[发明专利]含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物分子领域，尤其涉及含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用。

背景技术

神经导向因子Slit是一种在进化上高度保守的分泌型细胞外基质糖蛋白，其基因在1988年发现在中枢神经系统的形成中发挥作用。Slit是一组相对分子质量为170-190kDa的细胞外分泌蛋白，对轴突生长和神经元迁移起导向作用的轴突定向分子族成员之一。

Slit蛋白是作为Roundabout(Robo)的配体发挥多功能的导向分子，它不仅具有调节神经轴突生长方向、引导神经细胞迁移、影响神经细胞形态分化的功能。近年来的研究发现，Slit在血管生成、心脏形态发生、肿瘤细胞迁移等多种生理过程中也发挥作用。

在脊椎动物中存在3种Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3，并在各种生物组织中广泛表达。

Slit蛋白的主要结构包括N端的胞外分泌信号肽,4个连续的富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat，LRRs),也被命名为D1-D4结构域，串联的6-9个EGF(epidermal growth factor)样功能区，一个laminin G样结构域和一个富含半光氨酸的C末端结构域。

Slit2能够抑制神经胶质瘤、纤维肉瘤、乳腺癌、口腔鳞癌细胞的迁移，Slit3能够抑制恶性黑色素瘤细胞的迁移，也有报道称Slit2能够促进乳腺癌和结直肠癌细胞的转移。目前，Slit2对血管生成的作用仍存在争议，关于Slit2促进血管生成和抑制血管生成的两方面作用都有文献报道。Dunaway等发现，在Slit2单独存在时，体外和体内实验都证明其能促进血管生成；然而在Ephrin-A1存在时，Slit2则能抑制血管生成，说明体外相对简单的细胞实验环境得到的结果并不能完全反映体内的真实作用。

Anil Prasad等人的研究表明，过度表达Slit2可以抑制乳腺癌细胞以及小鼠体内肿瘤的生长；Tseng等人的研究表明Slit2可以减缓肺癌的发展过程；Yuasa-Kawada等人报道了Slit蛋白能够抑制乳腺癌细胞的迁移；Werbowetski-Ogilvie等人报道了Slit2能抑制成神经管细胞瘤细胞的侵袭；Yiin等人报道了Slit2能抑制大脑中神经胶质细胞瘤细胞的侵袭。综合考虑Slit2和/或Robo1基因在肿瘤中存在广泛的启动子甲基化而导致功能的缺失，以及Slit2对肿瘤发生发展的抑制作用。

为了研究和应用，有必要对Slit蛋白或其片段进行表达和分离纯化。然而，由于天然蛋白的含量有限，分离困难，因此需要开发高效的重组生产工艺。

在重组生产工艺中，高效地生产出构象正确且便于分离和纯化的目的蛋白，常常是较为困难的。常用的大肠杆菌表达系统虽然可以较高效地表达目的蛋白，但却常常需要复杂的复性工艺，且复性后的目标蛋白的活性往往难以令人满意。

当采用真核表达系统进行表达时，虽然避免了复性工艺，但目标蛋白的正确折叠、如何实现高表达水平以及如何有效分离目标蛋白仍然是难点，尤其是对于某些短肽或含重复序列的多肽而言。

获得了含目标蛋白的培养液(或发酵产物)后，可采用各种不同的纯化手段进行分离纯化。目前，一种常用的分离纯化重组蛋白的方法为亲和层析技术。

以采用的His标签为例，6×His是专门设计用于重组蛋白质纯化工作的标签蛋白，是目前最常见的表达方式，其表达纯化技术都很成熟，而且相对比便宜，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附，但是因为His标签非常小，如果在融合蛋白折叠过程中被折叠到蛋白内部而导致His标签不容易暴露的话，则很难开展蛋白纯化工作；同时His标签确实还存在特异性不够的问题。

通常，使用His标签技术分离所得的蛋白质纯度约为90%左右，而现有技术中，使蛋白进一步纯化的工艺和步骤都相对较为繁琐，且添加的蛋白或肽段常会对目标蛋白的活性造成干扰，导致目标蛋白的表达不准确或杂质过多。

综上所述，为了简便高效地制备高纯度、高活性的重组蛋白，本领域迫切需要开发高效简便的生产工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效简便的生产外源蛋白的方法，从而简便高效地制备高纯度、高活性的重组蛋白。

本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式Ia或Ib所述的结构：

A—X—E—Y1—Y2   式Ia；