[发明专利]快速检测转玉米PEPC基因作物的ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的ELISA试剂盒及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。 

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是玉米等C₄植物能够进行高效的光合作用,尤其是在低CO₂浓度和强光照下进行光合作用的关键基因之一。利用玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）转化水稻后可以获得在光合效率、光饱和点、低CO₂浓度补偿点等生理指标方面得到很大改善，而且在单株有效穗、穗总粒数、千粒重和单株产量等主要经济性状比原始亲本大幅度提高的转基因植株（KuMSB,etal,1999，2001；迟伟等，2001；JiaoDM，etal，2001，2002，2003，2007；ZhangF，2003；陈绪清等，2004；李季航等，2006；何立斌等，2006；李霞等，2003，2005，2007；袁定阳等，2007；BandyopadhyayA,etal,2007；张边江等，2008，2009；LauraM,etal，2008；李艳，2009）。已有研究表明，利用C₄型（如玉米、高粱等）的光合作用关键基因之一——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）来改良水稻、小麦等C₃植物具有潜在的重要的经济和社会意义。 

外源基因转入受体物种后，对目标基因的检测方法主要有三种：（1）生物测试法；（2）DNA检测；（3）蛋白的免疫检测。在这三种检测方法中，第一种方法比较繁琐且工作量大，劳动力成本较高，测定结果偏差大，难以进行横向和纵向比较；第二种方法只是检测目的基因是否存在，并不代表基因是否表达，实际指导意义不大。免疫检测方法方便、简单、实用、经济，灵敏性更高，而且可以直接鉴定基因产物的表达情况，双夹心酶联免疫法整个操作过程仅需要5个小时左右。 

随着越来越多的对PEPC基因（GenBank登录号E17154）的关注与深入研究，利用基因本身的生物学信息来提高选育转基因后代材料就显得越来越重要。然而，目前所有的有关PEPC基因的研究主要是集中在转基因后代的生理生化指标的检测和利用PEPC基因的核苷酸信息设计引物来分析目的基因的整合与表达，还未见快速检测该基因表达的方法报道。利用PEPC基因的表达蛋白作为抗原获取专一性的抗体制成ELISA试剂盒能够检测出转基因后代植株中PEPC基因是否得以表达，为育种家提供快速的检测结果。 

发明内容

技术问题 

本发明的目的是提供一种快速检测玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）表达蛋白的ELISA试剂盒。 

技术方案 

本发明的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）表达蛋白ELISA试剂盒包括： 

1）96孔酶标板：包被玉米PEPC蛋白多克隆抗体的酶标板（包被浓度1：1600-1：3200）；玉米PEPC蛋白多克隆抗体的制备过程：玉米PEPC蛋白免疫3月龄的新西兰大白兔，4次免疫后心脏采血，离心，取血清。 

2）玉米PEPC蛋白单克隆抗体：玉米PEPC蛋白免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，获得保藏号是CCTCCNO：C2012199的杂交瘤细胞4E5；玉米PEPC蛋白免疫BALB/c小鼠获得杂交瘤细胞4E5单克隆抗体（工作效价1：400-1：800） 

3）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（工作效价1：5000-1：10000）； 

4）阴性对照品：未转玉米PEPC基因的水稻蛋白提取液。 

5）样品处理液：50mmol·L^-1Tris-HCL，pH7.5，1mmol·L^-1MgCl₂，5mmol·L^-1DTT，2%PVP，10%甘油； 

6）稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01M，pH7.5）； 

7）洗涤液：磷酸盐吐温缓冲液（PBST）（1000mL0.01MPBS中加0.5mLTween-20）； 

8）底物溶液： 

底物缓冲液:Na₂HPO₄·12H₂O0.2g；NaH₂PO₄·2H₂O6.84g，双蒸水500mL；4℃保存备用；