[发明专利]一种氨氧化微生物的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种氨氧化微生物的分离筛选方法。

背景技术

由于氮素对水生生物圈富营养化的严重影响，以及对水生生物具有毒性，废水氨氧化引起人们越来越多的关注，生物氨氧化技术是废水脱氮最为经济有效的方法，可以实现真正意义上的氮去除。传统生物氨氧化工艺是多数废水生物氨氧化处理的主要承担者，但仍存在着硝化速率低、工艺复杂、氨氧化效率低等缺点，投加氨氧化微生物有助于提高生物氨氧化反应速率，提高处理效率。因此，分离筛选具有良好活性的氨氧化微生物极为重要。

目前关于氨氧化菌的文献报道多集中在富集培养方面，关于硝化菌的分离筛选方面相关文献报道并不多，专利CN200910223298A申请公开一种自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法，但是在富集过程中并不直观，需要随时取出菌液进行分析NO^3-生成情况，容易造成菌株流失。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行、快速有效的氨氧化微生物的分离筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种氨氧化微生物的分离筛选方法，将分离源在以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中富集培养；而后再经过显色平板和液体培养筛选得到具有氨氧化能力的菌株，收集的目标菌株用于污水处理，使其在有氧条件下氧化污水中的氨进行氨氧化反应；

所述以氨氮为单一氮源的液体变色培养基配制过程如下：

将(NH₄)₂SO₄2～3g、KH₂PO₄1～2g、Na₂HPO₄·12H₂O10～12g、FeSO₄·7H₂O0.03g、MgSO₄·7H₂O0.03g、溴百里酚兰40～80mg和酵母浸粉0.01～0.05g加入到1L无菌水中，pH为7.5～9.0；120～125度蒸汽灭菌15～20分钟后，放置冷却备用。

所述显色平板配制过程如下：将(NH₄)₂SO₄2g、FeSO₄·7H₂O0.03g、MgSO₄·7H₂O0.03g、酵母浸粉0.05g、琼脂15～20g、溴百里酚兰40～80mg加入到1L蒸馏水中，pH为7.5～9.0，120～125度蒸汽灭菌15～20分钟后，放置冷却到50～80℃后，倒制平板冷却后备用。

具体筛选过程为：

1）取分离源加入到其5～10倍体积的无菌水中，使微生物混合均匀；取混合液1～10ml加入到100ml以氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，以25～35℃，150～250转/分富集培养至培养液由蓝色变为橙红色，取1～10ml菌液再加入至新的氨氮为单一氮源的液体变色培养基中，继续富集培养至培养液由蓝色变为橙红色；再取20～30ml菌液重复富集培养3～5次，待用；

2）将上述富集培养至橙红色的菌液用无菌水稀释至10^-6～10^-9各梯度；

3）分别取上述稀释的各个梯度浓度的菌液50～200ul于显色平板，于25～35℃培养箱中倒置培养，待出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在显色平板上划线纯化培养；

4）将划线纯化培养得到的深红色的菌落接种至AOM固体培养基（AOM平板），培养3～5天后挑取单菌落接种到AOM液体培养基中，在25～35℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，检测菌液在600nm波长检测光下吸光值，OD600值大于等于1，氨氮去除率（残留氨氮浓度/氨氮初始浓度）大于等于50%的菌株即为高活力氨氧化菌株。

取上述氨氮去除率大于50%的且OD600值最高的菌液，在AOM固体培养基上划线，平板在25～30℃培养3～5天后，挑取单菌落接种到液体培养基中，在25～30℃，150～250转/分摇瓶培养5～7天，取菌液200ul加入1.8ml的20%甘油水溶液中，-70℃冰箱保存。

所述分离源为城市污水处理厂曝气池污泥或含氨废水工厂曝气池污泥。