[发明专利]一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法四重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者鼻咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物等标本中甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型核酸检测方法，可应用于H7N9型禽流感引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及发热呼吸道症候群患者中甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的流行病学的研究。

背景技术

甲型流感病毒H7N9亚型是全球首次发现的新亚型流感病毒，于2013年3月在上海和安徽两地率先发现。H7N9亚型是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。甲型流感病毒共有8个基因节段，依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前从禽类已鉴定出16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。目前从禽类已鉴定出16个H亚型（H1-H16），9个N亚型（N1-N9）。近一个世纪，在人间流行的流感病毒主要是H1、H2、H3和N1、N2等几种抗原构成的亚型，但禽流感病毒也可感染人，既往确认感染人的禽流感病毒有H5N1、H9N2、H7N2、H7N3、H7N7、H5N2、H10N7等。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。

    人感染H7N9禽流感是由甲型流感病毒H7N9亚型引起的急性呼吸道传染病。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

目前人感染H7N9禽流感诊疗的实验室检查包括血常规、血生化、病原学及相关检测及胸部影像学检查等。病原学检测是人感染H7N9禽流感的筛查、确认至关重要的环节。由于病原分离培养条件及技术要求高、周期长；而甲型流感病毒H7N9亚型作为发现的新亚型流感病毒缺少抗原和抗体，市场上尚未有成熟的快速诊断试剂；实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒，即一种用于甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型检测的一步法四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、标准品管（共有4管）、阳性对照品管（共有4管）、阴性对照品管和盒体组成。定量RT-PCR反应液管装有定量RT-PCR反应液，酶混合液管装有酶混合液，引物探针混合液管装有引物探针混合液，4个标准品管分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。

其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。

引物探针混合液管需避光条件保存，选用棕色管。

    四重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：

上游引物Influenza A-F: 5’- GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’

下游引物Influenza A-R：5’- GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’

特异性探针Influenza A-P: 5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’

上游引物H7-F: 5’- GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’

下游引物H7-R: 5’- CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’

特异性探针H7-P: 5’-FAM- ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’

上游引物N9-F: 5’- GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’