[发明专利]接骨木镰刀菌检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一套接骨木镰刀菌的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括一对特异性引物序列和Mix。

2.如权利要求1所述的接骨木镰刀菌的检测试剂盒，其特征在于：一对专一性PCR引物DNA序列为：Fs-F：5’-GAC CCA AAT CTA AGC TCG CC-3’，Fs-R：5’-GAA GGG CAT GTC GCT CAA G-3’。

3.如权利要求1所述的接骨木镰刀菌的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒Mix的成分为Taq酶(0.1-0.3 U/μL)、dATP (0.03-0.10 mM)、dTTP (0.03-0.10 mM)、dGTP(0.03-0.10 mM)、dCTP(0.03-0.10 mM)、MgCl₂(0.3-1.0 mM)、KCl(130-150 mM)、Tris-HCl(20-30 mM, pH 9.0-9.5)、1% Triton X-100及稳定剂。

4.如权利要求1所述的接骨木镰刀菌的检测试剂盒检测方法，其特征在于：提取病菌基因组DNA并测定浓度，利用特异引物，在给定条件下进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测，出现309 bp特异性扩增条带的菌株为接骨木镰刀菌。

5.如权利要求4所述的接骨木镰刀菌的检测试剂盒检测方法，其特征在于：鉴定接骨木镰刀菌的聚合酶链式反应体系为（参考反应体系为25μL）：

Mix               12.5 μL；

上游引物Fs-F    1 μL；

下游引物Fs-R    1 μL；

模板DNA          1 μL；

无菌ddH₂O     9.5 μL。

6.如权利4所述的试剂盒检测方法，其特征在于：鉴定接骨木镰刀菌的聚合酶链式反应条件为：

起始变性阶段：94℃、4 min；

变性阶段：    94℃、30-40 s；

退火阶段：    61℃、30-40 s；

延伸阶段：    72℃、20-25 s；

循环次数：    28个循环；

最后延伸阶段：72℃、7-10 min，反应结束后在4℃保存。

7.如权利要求1所述的接骨木镰刀菌的检测试剂盒，其特征在于：聚合酶链式反应检测接骨木镰刀菌基因组DNA的浓度极限值为70-100 pg/μL。