[发明专利]一种周年大规模转化玉米的方法

权利要求书

1.一种周年连续大规模转化玉米的方法，将幼胚和胚芽鞘节诱导愈伤组织为外植体的两种转化方法结合，主要包括以下步骤：

1）在玉米生长季节分批播种玉米受体材料，间隔4-7天播种一次；

2）将上述步骤1）中播种的玉米在散粉前严格套袋，自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在相同的数量；

3）上述步骤2）中授粉的玉米在授粉后9-13天，幼胚长至1.5-2.0mm时，剥取幼胚进行根癌农杆菌介导的转化，将幼胚放入侵染液中侵染，置于共培养培养基上培养，移入恢复培养基上暗培养一周，随后移入筛选培养基上筛选2－4轮，在胚状体诱导培养基上诱导形成胚状体，转入到分化培养基上进行分化，得再生苗；

4）在当年无法获得上述步骤3）的幼胚的时间段里，将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；

5）将上述步骤4）中得到的幼苗切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；

6）将上述步骤5）中得到的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上进行继代；

7）用农杆菌介导法将外源基因转化上述步骤6）中的愈伤组织；

8）将上述步骤7）中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体；

9）将上述步骤8）中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗；

10）将上述步骤3）和9）中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

浸染液是N6＋蔗糖68.5g/L＋葡萄糖36g/L＋L-脯氨酸0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L；

共培养培养基是N6＋蔗糖30g/L＋L-脯氨酸0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L＋硝酸银0.85mg/L＋L-半胱氨酸0.3g/L＋二硫代苏糖醇0.15g/L＋乙酰丁香酮100mM；

恢复培养基是N6＋蔗糖30g/L＋L-脯氨酸0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L＋硝酸银0.85mg/L＋2-吗啉乙磺酸0.5g/L＋头孢霉素0.25g/L；

筛选培养基是N6基本培养基＋蔗糖30g/L＋L-脯氨酸0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L＋硝酸银0.85mg/L＋2-吗啉乙磺酸0.5g/L＋头孢霉素0.25g/L＋Bialaphos 1.5-3mg/L；

胚状体诱导培养基是MS＋蔗糖60g＋头孢霉素0.25g/L＋Bialaphos 1.5mg/L；

分化培养基是MS＋蔗糖30g；

发芽培养基是MS＋麦芽糖40g/L＋酶水解酪蛋白0.1g/L＋谷氨酰胺0.5g/L＋2-吗啉乙磺酸2g/L＋MgCl₂·6H2O 1.6g/L＋抗坏血酸 0.1g/L＋6-BA 3mg/L＋毒莠定0.01g/L；

愈伤组织诱导培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋维生素B₁ 0.5mg/L＋酶水解酪蛋白 0.5g/L＋脯氨酸 1.5g/L＋硝酸银 5mg/L＋2,4-D 1.5-5mg/L＋毒莠定 0-0.001mg/L；

胚状体诱导培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋脯氨酸 0.7g/L＋6-BA 2mg/L；

再生培养基是MS＋蔗糖 20g/L＋肌醇 0.1g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。