[发明专利]一种检测苯乙醇胺A含量的方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品安全监督或食品分析的研究领域，涉及一种检测苯乙醇胺A含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，本发明还涉及相关检测试剂盒。 

背景技术

β-肾上腺素受体激动剂（简称β-激动剂）是一类结构和生理功能类似于肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇类衍生物，因为能与动物体内的大多数组织细胞膜上的β-肾上腺素受体结合而得名。β-激动剂能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率。因此，β-激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等。在国内外已有多起因食用含β-激动剂残留的动物肝或肺组织发生中毒的报道，出现头痛、心动过速、血压升高、狂躁不安等症状。因此，各国政府在动物饲养中都严禁使用β-激动剂。 

近年来瘦肉精中毒事件时有发生。最近又出现了一种新型瘦肉精：苯乙醇胺A。这种新型瘦肉精的出现，再次敲响我国食品安全警钟。苯乙醇胺A又称为克伦巴胺，化学结构式为2-[4-（4-硝基苯基）丁基-2-氨基]-1-甲氧基苯乙醇，英文名：Phenylethanolamine A（PA），是一种人工合成的化学物质。克仑巴胺是美国礼来公司合成莱克多巴胺的副产物，具有同瘦肉精莱克多巴胺相同的作用和效果，属于β-激动剂的一种，具有营养再分配作用。2010年底被农业部第1519号公告列为禁止在饲料和动物饮水中使用的物质。 

目前，苯乙醇胺A检测方法多为色谱分析法。如：农业部第1486号公告-1-2010中的高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的苯乙醇胺A。尽管色谱分析方法较准确，但液相色谱-串联质谱仪价格昂贵、操作复杂，样品预处理复杂、费时，检测成本高，不适合大量样品的快速筛选。 

酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，己广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。因而，建立一种简便高通量的应用于常规定量/筛选食品和饲料中苯乙醇胺A的ELISA分析方法具有十分重要 的实际应用意义。然而到目前为止，仍然缺少高灵敏度及高特异性的苯乙醇胺A的ELISA检测法。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种检测苯乙醇胺A残留的酶联免疫吸附分析方法。 

本发明的目的还在于提供苯乙醇胺A残留检测的检测试剂及检测试剂盒。 

本发明研究发现，对苯乙醇胺A进行特定修饰，得到半抗原，再偶联载体蛋白得到抗原，并作为免疫原免疫动物得到抗体，并由此建立的ELISA分析法能够显著提高检测灵敏度和特异性。 

据此，为实现本发明的目的，本发明首先一种苯乙醇胺A半抗原，其具有式（I）所示的结构式： 

该半抗原是将苯乙醇胺A溶于无水乙醇中，升温至80℃后加入水合肼、钯碳，氮气保护条件下80℃回流反应得到。其反应式如下： 

进而本发明提供苯乙醇胺A抗原，其为上述的半抗原与载体蛋白的偶联复合物。 

该抗原的制备方法是将上述的苯乙醇胺A半抗原溶解于水中，缓慢滴加NaNO₂溶液，并用盐酸调pH值为1.5，暗处4℃反应1～10小时，经初步测定重氮化完成之后，缓慢滴加尿素溶液终止反应，将上述重氮化溶液逐滴加入到0.01～0.02%的载体蛋白溶液中，调节pH为6～9，4℃缓慢搅拌1～10小时，透析1～5天即得。 

进一步本发明提供苯乙醇胺A的抗体，其为上述的抗原作为免疫原免疫动物制得。可以按照常规方法制得多克隆抗体或单克隆抗体。 

基于上述抗原和抗体，本发明提供苯乙醇胺A检测试剂盒，其包含上述的抗原和/或上述的抗体。 

具体地，本发明试剂盒包括：包被上述抗原的酶标板，上述的抗体；以及选自以下试剂的一种或多种： 

A）  酶标二抗； 

B）  底物液； 

C）  终止液； 

D）  标准品溶液； 

E）  封闭液； 

F）  洗涤液。 

所述抗原为所述的半抗原与牛血清白蛋白或卵清白蛋白的偶联复合物；所述抗体为所述的半抗原与牛血清白蛋白或卵清白蛋白的偶联复合物为免疫原制得的多克隆抗体；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG；所述底物液为TMB溶液；所述终止液为H₂SO₄溶液；所述标准品溶液为苯乙醇胺A溶液；所述封闭液为酪蛋白溶液；所述洗涤液为PBST缓冲液。 

上述检测试剂盒可以用于检测苯乙醇胺A，尤其是食品和饲料中苯乙醇胺A的检测。