[发明专利]一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法有效
| 申请号： | 201310139348.4 | 申请日： | 2013-04-19 |
| 公开（公告）号： | CN103194487A | 公开（公告）日： | 2013-07-10 |
| 发明（设计）人： | 滕小娟;开国银;季倩;时敏;崔丽洁 | 申请（专利权）人： | 上海师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/60;C12N15/53;A01H5/06 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227 | 代理人： | 吴瑾瑜 |
| 地址： | 200234 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 利用 基因 转化 策略 获取 喜树碱 新型 方法 | ||
1.一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H插入植物表达载体，构建重组载体；
(2)将步骤（1）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；
(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，获得毛状根；
(4)检测步骤（3）毛状根中的CrSTR和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；
(5)利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。
2.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（1）中的CrSTR和CrG10H基因片段以长春花幼苗RNA为模板PCR获得。
3.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（1）中的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。
4.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（2）所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402。
5.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（3）中用含有重组植物表达载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草茎段，获得毛状根。
6.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（4）所述的检测方法为PCR及Southern blotting检测。
7.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（5）所述的植物激素为茉莉酸、脱落酸、水杨酸或二甲基亚砜。
8.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（5）中，将所获得的毛状根液体培养35～45天后用植物激素诱导。
9.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，将步骤（5）获得的高产转基因毛状根粗提物进行抗肿瘤活性分析；所述抗肿瘤活性分析方法为MTT法。
10.一种用于提高喜树碱含量的重组载体，其特征在于，含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H。
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