[发明专利]一种用于分离RNA结合蛋白所结合RNA的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种分离结合于RNA结合蛋白上的RNA的试剂盒。

背景技术

基因表达的调控在生物体内细胞的生长、分化和应激反应等方面都起着重要的作用。但除通过转录因子对转录过程进行调控之外，细胞的转录后调控也在生理过程中起着重要的作用，其中包括通过RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)对mRNA转录速度进行特异性和快速的调控。目前，这种通过RBPs和非编码RNA对mRNA的调控机制的研究才刚刚开始。RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitating，RIP)是一种基于抗原抗体反应，通过免疫共沉淀的方法研究体内与RNA结合蛋白(RNAbindingprotein，RBPs)特异性结合的RNA转录本之间关系的技术。一方面大多数的RNA都需要和特定的RNA结合蛋白结合才能稳定存在于细胞中，进而发挥翻译模版的作用；另一方面，也有些RNA结合蛋白能够使结合的RNA降解加快以降低其对应蛋白质的翻译水平，防止某些蛋白质的过度表达。这种RNA结合蛋白对蛋白质翻译的平衡作用在生理过程中至关重要。除此之外，这种调节作用在RNA的转录、修饰、运输、降解以及翻译过程中都起到了重要的作用。RIP是利用RNA结合蛋白的抗体免疫沉淀RNA-蛋白复合物，再从沉淀的RNA-蛋白复合物中分离得到能结合特定RNA结合蛋白的那些RNA，得到的这些RNA可以通过RNA电泳、RNA测序、定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、基因芯片分析(RIP芯片)等分子生物学方法进行下一步生物分析。因此，通过RNA结合蛋白分离鉴定对应的RNA对RNA结合蛋白和RNA本身的研究都是不可或缺的研究方法。

但是，目前使用的方法不同，影响因素多，极易污染样品同时RNA又极易受到广泛存在的RNA酶的影响而常常导致最终所得收率极低且RNA质量不能保证。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离提取细胞中与特定RNA结合蛋白结合的mRNA的试剂盒。

本发明提供的用于分离结合于特定RNA结合蛋白上RNA的分离提取试剂盒，包括温和裂解液、缓冲液和磁珠。

试剂盒中的温和裂解液包括：浓度为100mM的KCl，浓度为5mM的MgCl2，浓度为10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，浓度为0.5％的表面活性剂，浓度为100mM的二硫苏糖醇，浓度为100单位/mL的RNA酶抑制剂，浓度为0.05mg/mL的苯甲基磺酰氟，1μg/mL的抑肽酶，1μg/mL的亮肽素，1μg/mL的胃蛋白酶抑制剂。焦碳酸二乙酯处理后的超纯水。

试剂盒中的缓冲液包括，pH7.4，浓度为50mM的Tris、浓度为150mM的NaCl、浓度为1mM的MgCl₂和浓度为0.05％的表面活性剂Nonidet P-40。

使用本发明的试剂盒进行RNA结合蛋白上RNA分离的步骤如下：

1.细胞样品的mRNP裂解液的准备：细胞样品，每组准备3×10⁷个细胞(约100mm培养皿3-4个)，用含胎牛血清的完全培养基轻柔洗一次，再用预冷10mL磷酸盐缓冲液洗一次，加适量3mL磷酸盐缓冲液后用细胞刮刀收集后离心，用4倍于细胞离心团块体积的预冷裂解液重悬，轻柔重悬后与冰上放置10分钟充分裂解，收集细胞样品于-80℃储存过夜，利于细胞的破碎。

2.第二天，将细胞裂解液于冰上解冻，裂解液于4℃离心30分钟，14000×g，上清液转移至无酶EP管中，置于冰上备用。

3.用Bradford或考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，蛋白浓度为15μg/μL左右，每个样品最少需要3mg的裂解物。

4.磁珠的洗涤准备，提前一天开始：用缓冲液重悬磁珠A和磁珠G得到均匀重悬溶液，将1mL磁珠转移到EP管中，将EP管置于磁力架上，1分钟后，轻轻吸去上清，将EP管从磁力架上取下，加入2mL缓冲液温和重悬，重复以上操作2次后，将EP管置于磁力架上，1分钟，轻轻吸去上清，将EP管从磁力架上取下，加入400μL溶液温和重悬，分装到2个EP管，立刻进行下一步。

5.抗体的包被：抗体200μg加入100μL磁珠A，IgG抗体90μg加入100μL磁珠G，各自通过溶液补足体积1200μL，置于旋转仪上温和混悬，4℃包被过夜，包被后的磁珠A和磁珠G分别用1.6mL缓冲液洗涤4遍，步骤同4，洗涤后立刻使用。

6.加样如下：包被后磁珠100μL，DTT20μL，RNase OUT12μL，0.5M EDTA66μL，细胞裂解物6mg，最后补足体积1.2mL。