[发明专利]马立克氏病病毒快速检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测马立克氏病的器具，特别是涉及一种快速检测马立克氏病病毒的胶体金试纸条。

技术背景

马立克氏病（Marek’s disease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病。该病以外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤单核细胞的浸润和肿瘤形成为主要特征。临床上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多种实质脏器的淋巴肿瘤，以肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻痹, 最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。根据症状和病变发生部位, MD在临床上分为四种类型，即神经型、内脏型、眼型和皮肤型，有时也可混合发生。MDV主要危害鸡，鹌鹑、山鸡也有发病。 

MDV有三种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原, 也含有特异性抗原。近年来MDV的毒力呈不断增强趋势，至今已发生三次大的毒力变异。 MD免疫的失败在世界各地屡有发生，我国也存在类似情况。因此，及时对临床病例进行快速诊断，对该病的有效防控具有重要意义。 

MD的诊断主要有病毒分离培养、血清学检测、病毒核酸检测和病理组织观察、DNA 探针技术、端粒酶活性检测等手段，目前临床上最常用的是前三种。病毒分离鉴定不但对临床诊断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需 1-2个月，同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学检测方法包括荧光抗体法（FA）、免疫过氧化酶法、琼脂扩散试验（AGP）及酶联免疫吸附试验（ELISA）。这些方法都需要在实验室内由专业技术人员操作，主要用于检测毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及细胞培养物等样品，但在淋巴瘤和潜伏感染的组织中很难检测到MDV抗原。病毒核酸检测主要是用PCR技术检测组织样本或细胞培养物中的MDV病毒基因组DNA，可以用于鉴别诊断致弱毒株和野毒株。与病毒分离培养相似，分子生物学检测方法操作复杂、需要特殊仪器及专业技术人员。血清学方法虽然相对简便，但仍需要荧光显微镜、酶标仪和许多配套试剂，以及较复杂的操作步骤和实验室工作环境，不适合生产或现场的快速诊断，因此，该方法难以在生产基层或兽医临床上推广应用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种简便、准确、结果直观、肉眼可判的快速检测马立克氏病病毒的试纸条，与其他检测方法相比，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、结果显示快，检测成本低廉。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案： 

一种快速检测马立克氏病病毒MDV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV抗体的检测印迹，所述抗MDV抗体为抗MDV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV的多克隆抗体或单克隆抗体。

所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。 

所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成；所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。 

在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7 cm处印制有样品标记线，检测印迹与对照印迹的排列组合为“‖”、“/ /”、“＋＋”、“┴┴”、“┬ ┬”、“├├”中的一种。 

所述胶体金标记的抗MDV的单克隆抗体是通过以下方法制备的： 

筛选抗MDV的单克隆细胞株，扩大培养，用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min，PBS洗2遍，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个细胞量对经产母鼠进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，得到单克隆抗体腹水；