[发明专利]一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种染色体重组增效蛋白基因（Enhancin）苏云金杆菌工程菌的构建方法，尤其是一种以转属主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌（Bt）为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-1将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因，从而构建稳定表达增效蛋白基因、无抗性标记基因的增效Bt工程菌的方法。

背景技术

长期以来，农业病虫害的危害主要依赖化学农药防治。我国农田化学农药有效含量年用量超过250000吨，致使农产品农药残留增加、害虫危害加重、生态环境破坏。推广应用生物农药，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是研究、应用范围最广的生物杀虫剂，其主要作用成分为具体代谢产生的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）或δ-内毒素（delta-endotoxin）。ICPs对多种重要的农林业害虫具毒杀作用，Bt已作为有效的微生物农药广泛应用于害虫的生物防治。然而受本身生物学特性的限制，在实际使用中存在毒力不强、杀虫谱窄、杀虫速度慢等影响大面积推广应用的问题，同时害虫对苏云金杆菌抗药性的产生和发展也越来越受到人们的关注，因此构建广谱、高效Bt杀虫工程菌成为苏云金杆菌杀虫剂研究与开发的新方向。

增效蛋白（Enhancin）最早是在粘虫颗粒体病毒（Pseudaletiaunipuncta granulovirus，PuGV）包涵体中发现的能提高核型多角体病毒侵染能力的生物增效因子，目前已在PuGV、粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia ni GV，TnGV）、棉铃虫颗粒体病毒（Helicoverpa armigera, HaGV）等8种颗粒体病毒、4种痘病毒、2种多角体病毒中发现这类增效作用的蛋白存在。增效蛋白对Bt毒力同样具有显著增强作用。将TnGV包涵体中纯化的增效蛋白加入Bt后饲喂试虫，测试的6种不同鳞翅目幼虫的死亡率提高了2-10倍；4种不同的Bt商品制剂中加入TnGV增效蛋白对粉纹夜蛾的防效提高了3-6倍。江苏里下河地区农科所自2000年开展转属主颗粒体病毒PuGV-Ps对Bt增强作用研究，证明PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，微量PuGV-Ps对Bt增效作用显著，同时可提高Bt对害虫的作用速度。颗粒体病毒增效蛋白的杀虫增效活性，在杆状病毒、苏云金杆菌等微生物农药的研究应用上具有广阔的前景。

目前构建Bt工程菌的主要途径是通过增加ICPs基因拷贝数、消除冗余质粒、辅助蛋白利用等手段提高ICPs基因的表达量。这种改造虽提高了Bt工程菌的杀虫活性，但某种意义上讲是通过提高ICPs使用浓度而提高防效，同样也存在由于增加ICPs选择压力带来的害虫抗药性风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法，本发明利用增效蛋白基因构建增效基因，在ICPs正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效，产品毒力强、杀虫谱宽、杀虫速度快，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-1将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。

上述染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法：

（1）PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆：室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En；扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En；