[发明专利]一种结构光快速扫描显微成像方法

说明书

技术领域

本发明涉及显微镜的成像方法，具体地说是指一种基于结构光显微镜的大样本快速成像方法。

背景技术

显微镜是一种已有300多年历史的精密光学仪器，它利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像。借助于显微镜，人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。显微镜的各种性能，尤其是它的分辨率关系到人类认识微观世界的能力。根据Rayleigh判据，传统的光学显微镜在横向和轴向均存在分辨极限。但相比之下，轴向分辨能力往往只有几微米到几十微米，影响了传统光学显微镜的层析能力。

机械切片是改善显微镜轴向分辨能力的传统手段，但只适用于片检等采样观察，在三维成像存在严重的图像配准问题。光学切片是另一类获得高分辨三维数据的方法，包括共聚焦显微镜、双光子显微镜、去卷积显微镜、选择性平面照面显微镜等，但其中没有任何一种技术能够同时满足大样本、高分辨、高通量（高速）、稳定的特点。随着在基因定位、脑网络连接等研究领域的深入，科学家们迫切要求一种可以对厘米尺寸量级的生物样本进行快速、稳定的三维荧光显微成像方法（B. Wilt et al, Annual Review of Neuroscience 2009）。

结构光显微镜是另一种仅通过改造常规荧光显微镜即可实现光学切片的新技术，最早是Neil等人在1997年提出（M. Neil et al, Optics Letters 2007）。它在荧光显微镜的基础上增加照明调制功能，产生一组不同相位的调制光照射在样本上，再通过软件计算得到不含焦平面外杂散荧光的清晰图像（又如美国专利US6376818）。由于结构光显微镜采用宽场成像，其成像速度较共聚焦显微镜有较大提升，但在探测厘米尺寸大样本时仍有不足。传统结构光显微镜采用宽场照明，面阵相机采集图像，如果像普通光学显微镜一样，其一完整断层图像都是由大量马赛克小图拼接而来，将直接带来以下几个问题：

（1）显微镜必须在同一位置进行多次曝光，而一般的空间光调制器的调制速度只有数十赫兹，在这种情况下，一方面成像速度受到了空间光调制器调制速度的限制，另一方面空间光调制器需要进行频繁的变换，对其鲁棒性提出了较高的要求；

（2）为了实现图像马赛克式的拼接，要求每幅图像都与相邻四幅图像有成像区域的重叠，导致较多的无效数据的产生的同时，也降低了成像的速度；

（3）每次样本移动、空间光调制器相位切换和相机曝光三个步骤的时间消耗分别是10²ms、10¹ms和10¹-10²ms量级。即样本移动，空间光调制器相位切换的时间占据了整个采集时间的一半以上，是限制成像速度的主要因素。

发明内容

本发明主要目的在于克服现有宽场结构光显微镜在用于大样本三维成像时所具有的成像速度慢，系统可靠性差和过多的冗余数据量等问题，而提供一种结构光快速扫描显微成像方法。

本发明采用如下技术方案：

一种结构光快速扫描显微成像方法，包括以下步骤：（1）计算机控制空间光调制器产生单一空间频率的调制图案，投影在样本断层上，投影的调制图案平行于样本移动的方向；（2）在保证调制图案相位不变的情况下，电控移动平台带动样本移动，并同步触发线阵相机进行拍照；（3）完成步骤（2）后，改变空间光调制器调制图案相位，再对相同成像区域进行扫描，直到完成结构光成像所需的不同照明相位图像的获取；（4）移动样本，对下一个相邻成像区域执行步骤（2）至步骤（4），如此反复，直至完成整个样本断层的扫描。

所述的空间光调制器是数字微镜阵列DMD、穿透式液晶LCD、反射式硅基液晶LCOS或电控移动或转动的光栅。

上述步骤（1）投影的调制图案平行于样本移动成像的方向中的调制图案的平行度误差要求≤0.5度。按照空间光调制器的不同，调节图案的方向既可以使用电子方式或通过机械旋转台实现。

所述的线阵相机是线阵CCD、线阵CMOS、具有时间延时积分功能的CCD、具有时间延时积分功能的CMOS、工作在线积分模式下的面阵CCD或工作在线积分模式下的面阵CMOS。

上述步骤（2）中的电控移动平台可以是二维或三维。电控移动平台的横向二维运动可获取一个样本表面完整的断层图像，轴向运动可实现连续断层扫描。

所述步骤（3）中不同照明相位图像的获取是指获取结构光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位图像。