[发明专利]一种心肌特异启动子

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于基因表达调控的启动子，特别是一种用于基因表达调控的心肌特异启动子。本发明还涉及所述启动子用于调控心肌内基因表达的用途以及用于制备预防或治疗心血管疾病的药物的用途。

背景技术

心血管疾病是一类严重威胁人类健康的疾患。在我国，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势。目前，心血管疾病治疗方法包括药物治疗、血管介入成形术、外科血管搭桥术以及治疗性血管新生等。治疗性血管新生又称“分子搭桥术”或“生物搭桥术”，是指采取一定的措施促进缺血区血管新生以达到治疗的目的，通过促进缺血局部新生血管的生成，形成和开放新的侧支循环通路，完成心肌缺血区域血管的自我搭桥，从而减缓心肌缺血。

治疗性血管新生为心血管疾病病人提供了全新的治疗策略。目前治疗性血管新生的方法主要包括蛋白治疗、细胞治疗和基因治疗等。蛋白治疗是治疗性血管新生最早采用的方法，但血管生长因子在体内的半衰期短，需要持续注射，全身应用效果有限，单次剂量较大时可能导致血流动力学紊乱，还可能对其他器官产生不利影响。细胞移植的方法主要为细胞同种异体移植和细胞自体移植，但还存在分子生物学作用机制、细胞来源的种类与保障、细胞移植数量与移植途径等问题。因此，基因治疗成为促血管新生的另一选择。基因治疗是指把编码有促血管新生因子或血管新生调控因子的基因通过载体转染到宿主细胞，在体内翻译表达相应的蛋白，从而有效地促进缺血组织的新生血管生长和侧支循环的形成。多种血管生长因子，如血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）、成纤维细胞生长因子（Firoblast Growth Factor,FGF）、血管生成素（Angiopoietin,Ang）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等能诱导缺血心肌血管新生并改善心脏功能。虽然基因治疗也还存在一些问题，但各国科学家们一直没有停止对基因治疗的探索，并取得了积极成果。在缺血性心脏病的基因治疗方案中，利用重组腺病毒和质粒载体携带VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF-2、FGF-4等促血管生长因子基因药物已经在国外进行I、Ⅱ期临床试验，初步临床试验结果表明缺血性心脏病的基因治疗是安全而有效的。

虽然生血管因子基因治疗缺血性心脏病的研究成果令人鼓舞，但仍存在诸多问题，如基因转导和表达的低效率、载体引起的免疫反应、未调控生血管因子过度表达以及心脏外脏器血管的新生等，尤其是未调控生血管因子过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了生血管因子基因治疗心脏病的安全性。为控制心脏外脏器血管的新生，目前主要通过以下两种方法：（一）改善传递途径。直接将生血管因子注射到心肌缺血区有助于提高转导浓度，或选用合适的基因传递工具，如使用腺病毒载体代替质粒载体提高了转导效率。但是，通过改善传递途径还无法完全调控基因在心脏表达。因此，必须进一步改善对基因表达的调控。（二）选择组织特异性启动子。启动子是一段提供RNA聚合酶定位的DNA序列，通常位于基因的上游，一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等相互作用是启动子调控模式的实质。启动子对外源基因表达水平影响很大，它是基因工程表达载体的重要元件。目前研究表明，有一组启动子具有一定的心脏特异性，如人结蛋白(human desmin,Des)、α-人肌球蛋白重链(human alpha-myosin heavy chain,α-MHC)、心脏肌球蛋白轻链-2(cardiac myosin light chain2v,MLC-2v)、人心脏肌钙蛋白-C(human cardiac troponin C,cTnC)。其中，Des启动子组织特异性分析表明，其除表达在心脏外还表达在小脑、子宫内膜、骨骼肌和侧脑室；α-MHC、MLC-2v、cTnC启动子在心脏和骨骼肌都有表达。为此，寻找心肌特异表达的启动子显得极为重要。肌钙蛋白(Troponin,Tn)是一横纹肌收缩调节蛋白，有三个亚单位：肌钙蛋白I(Troponin I,TnI)、肌钙蛋白T(Troponin T,TnT)、肌钙蛋白C(Troponin C,TnC)。TnI是抑制性亚基，结合于肌动蛋白，抑制肌动蛋白三磷酸腺苷酶激活。在鸟类和哺乳动物，肌钙蛋白I三个亚型有不同的基因编码。快骨骼肌亚型(fast skeletal isoform,TnIf)表达在快牵拉骨骼肌纤维，慢骨骼肌亚型(slow skeletal isoform,TnIs)在发育期表达在心脏和慢骨骼肌纤维，在成体动物表达在慢骨骼肌纤维。肌钙蛋白心脏亚型（Cardiac Troponin I,TnIc)因其心脏特异性，已被世界卫生组织列为诊断心肌损伤的金标准。因此，TnIc启动子为心脏特异表达提供了理想工具。编码TnIc蛋白的基因是TNNI3，其包含了8个外显子及7个内含子构成的6.2kb的DNA,其5＇端的2300bp启动子在心肌中高度保守，据此推测，TnIc在心肌的特异表达可能与其高度保守的启动子序列有关。由于启动子结构复杂，包括多种功能结构域，有的结构域负责组织特异性，有的能够增强表达效率，还有结构域扮演了负调控作用，因此筛选出具有组织特异性且高表达效率的核心启动子序列，对于基因工程研究、基因治疗具有重要意义。但到目前为止，TnIc启动子序列中具体哪一段结构域能特异性调控目的基因在心肌表达，尚未见文献报道。