[发明专利]一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于环境污染控制和治理领域，具体涉及一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法。

背景技术

在环境污染治理工作中，利用微生物降解污染物的环境生物处理技术一直是污染物处理的主流技术。环境生物技术处理的对象一般是各类有机污染物或具有还原性质的无机污染物，微生物对这些污染物的降解能力对处理效果具有决定性影响。当处理对象中含有难生物降解的污染物时（例如针对一些工业废水和废气），筛选并应用污染物高效降解菌（称为生物强化）往往对工艺快速启动和提高处理效果具有明显效果和重要意义。目前，传统的降解菌筛选方法一般是从可能含有高效降解菌的混合培养体系中分离出大量单一菌株，再利用摇瓶间歇培养的方法对不同菌株的污染物降解能力进行比较和选择。由于分离出的备选单一菌株多、降解实验周期长、污染物分析过程复杂等原因，基于摇瓶间歇培养的高效降解菌筛选方法往往存在工作量大、药剂消耗多和筛选速度慢等缺点。因此，研究开发快速高效的降解菌培养方法对于缩短菌种筛选的工作周期和难度具有重要意义。

基于微平板（microwell plate）的生化反应测试和细胞培养技术在生物、医学、环境等领域已经得到了广泛应用，例如酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、MTT细胞培养实验等。微孔的个数可根据需要设计，最常见的是96孔板。在微平板上，每个微孔就是一个小的间歇反应器，可以根据需要加入各种底物、酶、细胞、组织或显色剂等，并很方便地控制培养或反应的条件。在微平板培养过程中，往往通过对某些反应产物的颜色或吸光度的测定来判断反应的进程。由于具有体积小、消耗药剂少、所需培养空间小等优点，使用微平板在同样的实验室配置条件下可以完成大批量、高通量的样品测试任务。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，基于微平板的特点和难降解污染物高效降解菌筛选的需求，本发明提供了一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，该方法可以对从菌种混合体中分离出来的大量单一菌株在同一块微平板上同时培养，并通过MTT（噻唑蓝）显色判断菌株代谢和对污染物的降解能力；使用该方法的药剂（包括菌剂）消耗量少、培养周期短、无需测定污染物浓度、占用空间小、实验人员工作量大幅减少，可同时实现大批量菌株的同时检测，显著缩短菌种筛选的时间，提高了菌种筛选的效率；发明用显色的方法代替了污染物浓度分析，从而实现了快速、高效的污染物降解菌筛选。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，包括如下步骤：

步骤1，取含有相应污染物高效降解菌的土壤、污泥或生物膜样品，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；

步骤2，取上述含有混合菌种的菌悬液，在平板培养基上通过多次划线分离得到多个单一纯菌株，用无菌棉签分别挑取菌落并用无菌生理盐水进行3次洗涤，得到多个含有待测单一菌种的菌液，调节菌液浓度使其在600nm下吸光度（OD600）为0.1-1.5；

步骤3，根据所需处理的难降解污染物溶解度配制饱和的基质母液，并配制氯化铵和磷酸二氢钾组成的无机盐营养液，调节pH至所需范围，其中无机盐营养液中氯化铵浓度为1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0-2.0g/L；

步骤4，取某一种待测纯菌菌液，将10mL菌液、10mL基质母液和180mL无机盐营养液加入96孔微平板上的某个微孔中，将同样的组分加入相邻的另外2个微孔中，针对同种待测纯菌形成3个平行样；

步骤5，重复步骤4的操作，取其他待测纯菌菌液，按顺序加入96孔微平板的相应微孔中。在同一块微平板上，同时设置3个不含菌液和3个不含基质母液的对照微孔；

步骤6，在所有微孔中加入10mL浓度为5g/L的噻唑蓝（MTT）显色剂，然后用酶标仪测定各个微孔的OD600作为显色前的初始值；

步骤7，将微平板盖好，用封口膜密封后，放入培养箱进行培养，培养温度20-50℃，培养周期8-24h，每隔2-3h，取出平板用酶标仪测定各个微孔的OD600值；

步骤8，在培养结束后，按照以下标准判断不同菌株对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降解能力的高效菌：

对照微孔内OD600的增加值小于0.05，表明检测结果有效，样品没有受到污染，在培养结束时，加入菌液和基质的微孔OD600的增加值越大，表明相对应菌株对污染物的降解能力越强。

所述微平板为96孔微平板，单个微孔总体积300mL。

本发明与现有技术相比，在菌种培养和筛选方面具有以下优点：