[发明专利]一种通过胚乳特异性沉默小麦脂肪氧化酶基因表达提高储藏小麦发芽率和面粉白度的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及特异性抑制小麦脂肪氧化酶基因在小麦胚乳中的表达的LOX-RNAi表达盒，采用胚乳特异性启动子组织特异性地抑制LOX表达的载体构建策略，以及培育具有提高的种子耐储藏性、发芽率和面粉白度的转基因小麦的方法。

背景技术

植物种子在自然状态或者储藏条件下，随着时间积累逐渐失去生命力或发芽能力的过程即称为老化。研究表明，种子萌发所必需的酶类失活或蛋白降解以及由于脂质降解造成细胞膜通透性增加是种子老化的主要原因(Walters，1998)。对于粮食作物，种子老化带来的影响是多方面的。粮食长时间储藏会发生陈化变质，造成品质下降和食用性下降，进而造成粮食浪费。在储藏过程中，种子逐渐衰老，生活力下降，如果用来播种会造成出苗率降低，从而影响农业生产。在国家粮食储备过程中，粮食的陈化变质一直是影响国家粮食安全储藏的重要因素之一，每年给国家造成重大的财政损失。据统计，我国粮油初级产品如玉米、水稻、小麦、大豆、花生、油菜等，在储藏过程中因陈化变质、霉变等因素造成的损失占粮油产量的8-14％。其中仅国家储备粮的陈化变质，造成的经济损失就上百亿元。因此粮食储藏在国家安全中扮演着特殊角色，确保我国的粮食储藏安全是一个重要课题。

国际通用的储藏防陈化方法有：低温储藏(自然低温、机械通风降温、空调降温等)；气控工艺(密闭缺氧、充氮气、充二氧化碳等)；水控(机械通风降低种子含水量、机器干燥等)；药物熏蒸。但上述成本投入巨大，占用了国家大量财政支出。目前去除种子陈味的方法有加热、有机溶剂抽提等，然而加热处理会导致许多重要蛋白的变性、并且温度过高会使氨基 酸降解，加之这些方法操作复杂、花费较高等原因不适合食品工业的要求。因此对一个发展中国家来说，培育耐储藏作物具有客观需求。

储藏种子发生陈化霉变的一个重要原因是植物种子中多链不饱和脂肪酸的氧化降解。多链不饱和脂肪酸氧化降解可以形成脂肪酸氢过氧化物和自由基，对蛋白质、细胞膜结构、细胞组织及DNA造成损伤，从而使种子失去发芽能力。此外，不饱和脂肪酸氧化降解后产生的一些小分子醛类物质，如仓储稻米所产生的霉腐气味物质，及仓储大豆所产生豆腥味物质，是影响种子品质的关键因素之一。

催化氧分子与多链不饱和脂肪酸反应的首个酶是脂肪氧化酶(EC1.13.11.12，Lipoxygenase，LOX)(Loiseau et al.2001)。LOX是一类不含血红素铁，广泛存在于动物、植物、真菌及微生物中的氧化酶，它存在于植物细胞的微粒、胞质和液泡中，催化不饱和脂肪酸(植物中的天然底物为亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸)形成不稳定的氢过氧化物(hydroperoxides，HPODs)(Kuhn et al.2005；Liavonchanka and Feussner，2006；Schneider et a1.2007；李等，2010)。LOX蛋白是由单条肽链组成的，其N端含有一个β-桶结构域，C端含有一个非血红素铁的催化中心，铁与保守的组氨酸及蛋白C端保守异亮氨酸的羧基结合，当铁为二价时，酶无活性；当铁被氧化为三价时，酶具有活性。LOX酶与底物的相互识别并结合是由β-桶结构域起作用的(Liavonchanka and Feussner，2006)。根据对亚油酸的氧化位点的选择，LOX可分为9-LOX和13-LOX。而根据基因序列的差异，可以将LOX分为不含有叶绿体定位肽(type-1)和含有叶绿体定位肽(type-2)两类(Shibata et al.1994)。前者在氨基酸序列上具有较高的保守性(70％)，而后者的保守性较低(40％)。

研究表明LOX在植物多个组织和器官以及植物生长发育的多个时期均有表达(Porta and Rocha-Sosa，2002；Baysal and2007)。在植物组织中LOX催化产生的HPOD参与了很多重要信号分子，如脱落酸和茉莉酸的合成(Creelman et al.1992；Staswick and Tiryaki，2004)，因此对植物的生长发育及抵抗各种生物和非生物胁迫均发挥重要作用。如LOX的mRNA表达水平及其催化产物会因机械损伤、病原菌侵袭、昆虫咬噬、缺水等因素的存在而提高，进一步表明LOX参与植物的多个生理学过程 (Moran and Ihompson，2001；Vellosillo et al.2007；Sayegh-Alhamdia et al.2008；Sanier et al.2012；Grebner et al.2013)。