[发明专利]团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新天然抗菌肽，具体是指一种团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

细菌对传统抗生素的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。WHO将抗生素耐受描述为“影响所有国家的全球公共健康紧急事件”，而且这一问题导致全球健康问题的比例在逐渐增加，因此，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。近年来出现的抗菌肽就是一类发展潜力巨大的新型抗菌类药物，它不仅对细菌和真菌有广谱杀灭作用，而且还具有很好的抗病毒和抗肿瘤作用，另外，与传统抗生素相比，其作用机制独特，不易引起微生物的耐药性，绝大多数不损害或破坏高等动物的正常细胞，因此它极有可能成为在临床上替代抗生素来治疗细菌感染的新型药物。

相比陆生动物和高等哺乳动物，鱼类的抗菌肽种类更丰富，也更具有独特性，是抗菌肽生物资源中还没有得到有效开发的巨大宝库。已有报道证实，鱼类某些抗菌肽比高等脊椎动物具有更强的杀菌活性，因此，对鱼类抗菌肽的开发利用研究具有重要的科学意义和实际应用价值。防御素是一组小的阳离子抗菌肽，根据半胱氨酸残基位置及二硫键连接方式的不同，可α，β，θ三种防御素，其中β防御素(β-defensin)因广泛表达于机体各组织和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，被认为是最重要的防御素。但是天然防御素来源有限，化学合成也存在成本高、批量生产困难；防御素抗菌活性与肽分子的空间结构密切相关，体外合成的防御素与天然防御素虽然一级结构一致，但空间结构却不尽相同，因而造成活性较差。因此，采用基因工程方法制备防御素将具有很大优势。巴斯德毕赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工、修饰的特点，且发酵条件简单，表达水平高，适合高密度培养，为工业化和纯化提供极大的方便。

发明内容

本发明的第一个目的是从团头鲂中获得β防御素基因。

本发明的第二个目的是将所述团头鲂β防御素基因在酵母表达系统中高效表达获得重组表达蛋白。

本发明的第三个目的是提供重组蛋白的应用。

（1）本发明所述团头鲂β防御素基因的获得：利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法，以团头鲂肝脏总RNA为模板，经RT-PCR得到团头鲂β防御素基因，其cDNA序列的开放阅读框（ORF）如序列表SEQ ID NO：1所示。

（2）编码了所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

（3）所述团头鲂β防御素重组蛋白（或多肽），其制备方法为：将序列表SEQ ID NO：1所述的团头鲂β防御素基因开放阅读框（ORF））与酵母表达载体构建重组表达质粒pPICZα-BD1，电转化至毕赤酵母工程菌GS115中，抗生素Zeocin筛选高抗性的转化子，并用甲醇诱导表达。收集上述甲醇诱导表达的上清液，对其进行分离纯化的蛋白或多肽即为团头鲂β-防御素1重组蛋白（或多肽）。

（4）本发明获得的团头鲂β防御素重组蛋白具有生物活性，具有抗菌作用。采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定实验证明：团头鲂β防御素重组蛋白对部分革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和部分革兰氏阴性菌如大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，而且团头鲂β防御素重组蛋白对氨苄耐药型的嗜水气单胞菌和大肠杆菌抑菌作用明显。因此，本发明的团头鲂β防御素可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括医药产品如抗菌药物、饲料添加剂、兽药、防腐剂等。

本发明的有益效果：

本发明涉及的团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌、链球菌及氨苄耐药型大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，为抗感染药物及耐药型细菌提供了一类疗效好的新药品。本发明所提供的团头鲂β防御素重组蛋白的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的化学合成方法活性较好、降低成本，缩短制备时间，有利于工业化生产。

附图说明

图1为团头鲂肝脏总RNA电泳结果。

图2本发明所述团头鲂β防御素基因RT-PCR扩增产物。1：目的基因；M：DNA分子量标准（购自大连宝生物）。

图3为本发明所述利用表达引物扩增团头鲂β防御素基因的产物。1：目的基因；M：DNA分子量标准（购自大连宝生物）。