[发明专利]一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞

说明书

技术领域

本发明属于基因克隆技术领域，涉及一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞。

背景技术

奶牛乳腺炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学刺激，尤其是细菌的侵袭而引起的一种炎症反应，造成奶牛产奶量下降，奶品质降低，增加生产成本，严重的使奶牛提早淘汰，给奶业发展造成了巨大的损失。据统计资料显示：世界上大多数国家乳腺炎的发病率平均约40%、美国高达48.5%、芬兰30.6%、加拿大19.8%、中国30%(Gill J.J etal,2006)。尽管引起奶牛乳腺炎的病原菌有137种之多(Ranjan R etal,2006)，但是金黄色葡萄球菌是最常见的乳腺炎病原菌之一，占到发病率的15-30%，通常引起亚临床型或者慢性感染(Sutra L etal,1994)。目前，治疗乳腺炎仍然采用抗生素治疗，尽管有效但治愈率低下，通常不足15%。这是由于金黄色葡萄球菌在感染的过程中形成荚膜，在乳腺上皮细胞和巨噬细胞里存活，从而导致对抗生素的不敏感(Almeida R.A etal,1996;Hebert A etal,2000;Hensen S.M etal,2000)。由于抗生素的长期使用，自然界中金黄色葡萄球菌的耐药性不断增强。从牛奶样本中分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经证明对万古霉素治疗几乎没有效果(Makovec J A etal,2003;Lee J2003)。耐药金黄色葡萄球菌的产生引起了人们极大的关注，如果它随着乳制品进入人体将产生很大的危害。因此，迫切要求寻找高效安全的新型抗菌药。

自身能够特异性的在乳房携带或者分泌抗乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。转基因动物的生产可以追溯到20世纪70年代中叶，用原核纤维注射生产转基因动物持续了20多年，但外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不准确性限制了这种技术的广泛应用。在小鼠上，胚胎干细胞可以代替原核注射，但胚胎干细胞系还没有在家畜上建立。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力，其突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植（SCNT），这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本。

在杀灭金黄色葡萄球菌的药物中，溶葡萄球菌素（Lys）是独一无二的，无论是处于分裂期还是静息期，带荚膜和不带荚膜的金黄色葡萄球菌都有很强的杀菌能力。正因为如此，它可能更适合用在发病初期需要快速减少细菌数量的病例中。更重要的是，在目前有限的研究中，已经证明溶葡萄球菌素单独或者联合其他抗生素能够有效地治疗MRSA感染且无过敏反应。由于溶葡萄球菌素的独特性、低毒，高稳定性和高效性等优点，使其在未来预防和治疗金黄色葡萄球菌感染具有极大的潜力。

基因打靶也称为基因定点同源重组，是指通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。通过基因打靶可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下去。基因打靶的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，直到1985年Smithies等才首次报道在肿瘤细胞中实现人工打靶载体和内源β球蛋白基因间的同源重组，1987年Smithies和Capecchi的研究小组在小鼠胚胎干细胞实现了定点剔除，现在基因打靶技术在生命科学的多个领域都有应用。随着基因打靶技术的发展，已经出现了一些新的技术如ZFN技术和TALE技术，科学家利用ZFN技术和TALE技术在基因组特定位点产生双链断裂（DSB），DSB的产生大大提高了体细胞同源重组的效率。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞，利用所构建的细胞作为核供体细胞，为研制抗乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种Lys乳腺特异性打靶载体，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。

所述的目的基因Lys的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的5’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。