[发明专利]实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法

说明书

技术领域：

本发明涉及实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究^[5]。对于某些应用，核酸定性检测就可以满足需求；而另外一些应用，要求进行定量分析。常规PCR中，扩增产物(扩增子)是通过终点法来分析检测，即PCR反应结束后，DNA通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像分析。而荧光定量PCR可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量。

相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即q-PCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。

1996年荧光PCR技术首次由美国AppliedBiosystems公司推出，它是在总结PCR技术的的基础上发展起来的实时定量技术。主要运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针和cDNA结合，然后利用DNA聚合酶的5’-3’的外切活性将探针切断，使探针由于能量传递结构的破坏而发出荧光。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。

实时定量PCR(q-PCR)是基因表达分析中一种最常用的技术，能同时测定基因在不同组织中的表达量，而且只需要微量的初始样本量。然而采用荧光定量技术研究基因的表达量需要对初始数据进行标准化，因为不同样本间TotalRNA的初始含量是不同的(特别是在活体的组织中)，这是由于在RNA提取和cDNA合成过程中大量的误差造成的。为了控制这些不是实验设计造成的变异，看家基因被广泛的使用。理想的看家基因是在不同的组织不同的阶段能够持续恒定的表达，且不受实验处理的影响和在同样的基因定量分析数据过程中能够产生同样的效应(即具有可重复操作性)。在之前试验中看家基因的选择往往是凭借经验进行的，所选择的看家基因在不同的组织或者不同的条件下能否稳定地表达并没有经过验证，容易造成最后分析结果的不准确，目前对mRNA的看家基因相关方面的评估已经引起关注和重视，已有大量的文章对此进行报道，其中包括猪的。由此可见，选择一组可靠的看家基因数据对标准化定量数据至关重要的，如果选择不正确会造成定量分析中的结论不准确。

在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：相对定量和绝对定量。相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量。

绝对定量是通过样品的CT值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。绝对定量中，未知样本的量(即拷贝数或单位数量)可以通过从已知量的标准品范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样置于同一次实验中进行反应，用稀释的标准样品构建标准曲线，通过推算来确定未知样本中目的基因的量。这与用分子量标记来判定琼脂糖凝胶上未知DNA条带分子量大小的原理相似。