[发明专利]磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法

说明书

技术领域

磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

吡咯并喹呤醌（pyrroloquinoline quinine PQQ）是一种新的氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含量较高，被认为是体内必需的维生素之一。

生物样本中PQQ的分析方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱、毛细管电泳法等[文献方法1：Zdeneˇk Glatz*,Martina Moravcova′,Oldrˇich Janiczek，Determination of pyrroloquinoline quinone by capillary zone Electrophoresis，Journal of Chromatography B,739(2000)101–107.]。毛细管电泳是二十世纪80年代发展起来的一种快速分析方法，具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗量少的优点。与高效液相色谱法相比，毛细管柱容易清洗、使用寿命长。文献报道的PQQ毛细管电泳检测法是在缓冲体系加入β-丙氨酸，采用反相C18小柱固相萃取分离富集细胞培养基中的PQQ，检出限为0.1～0.2μM，PQQ峰型存在拖尾现象，固相萃取所用的C18小柱价格昂贵，而且步骤繁琐，工作量大。

近年来，磁纳米固相萃取技术在生物样品制备领域受到广泛关注。由于磁性萃取介质直接分散于样品溶液中，接触面大，对生物样品和液体中含固体悬浮物的样品尤其适合，样品处理简单。本发明采用SiO₂与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。

本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，使PQQ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离。

本发明的技术方案：一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的41.5cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min；每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min；

运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kv，毛细管柱温25℃；

运行缓冲液为：pH=8.8、10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精-质量浓度0.1%三氟乙酸的混合液。

（3）生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测

选用牛奶作为生物样本的典型，

①Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：

100mL1.25mM FeSO₄·7H₂O60℃下搅拌，用6M NaOH调pH至10，1h后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60℃真空干燥6h，得Fe₃O₄磁性纳米粒子；

②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8的制备：