[发明专利]适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及适应鸡新城疫病毒增殖的BHK-α-2，3细胞系的建立方法及其应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒属(Paramyx-ovirus)成员，是有囊膜的负链RNA病毒。由NDV引起的新城疫(Newcastle disease，ND)是一种严重危害养禽业的高度接触性传染病，死亡率为90％以上，被国际兽疫局认定为两种A类禽病之一(另一种为禽流感)。

近年来，随着世界各国养殖业的发展，种禽频繁调动及疫苗的广泛使用，使得N D V的宿主范围不断扩大，抗原性和病毒毒力发生了变化，这给N D的诊断及N D V的实验室研究带来诸多困难.分离和增殖N D V常用的方法是鸡胚接种法，此方法简便易行，但由于鸡胚本身可能携带有一些垂直传播疾病的病原，对疾病诊断及实验室研究造成干扰.使用异源传代细胞制备ND疫苗可避免鸡胚传播其他疫病的风险，最大程度的减少了批间质量差异，使产品真正达到了使用安全，质量均一、稳定，关于NDV在各种细胞中的增殖研究国内外均有报道。研究表明，NDV可在鸡胚尿囊液中复制并产生感染性的病毒粒子，NDV强毒株可在多种体外培养细胞中复制，但是弱毒株只能在含有胰蛋白酶的细胞中进行复制。决定N D毒株毒力强弱的关键是融合(F)蛋白裂解位点的氨基酸组成和序列差异，F蛋白直接参与N D V的致病过程，鉴定F基因对N D V毒株毒力判定具有重要意义.

目前已有报道利用VERO细胞和MDCK细胞生产制备人用流感疫苗。因此，具备悬浮培养特性的BHK等一些细胞已成为新城疫病毒增殖不可缺少的一种宿主系统。部分毒株虽具备在BHK等哺乳动物细胞的复制增殖能力，但由于受体丰度较低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，给进一步深入研究乃至疫苗和抗病毒药物研制造成极大困难。提高BHK工程细胞系表面受体丰度，有可能改进新城疫病毒分离株的生长滴度及蚀斑形成能力。筛选稳定表达鸡ST3Gal I基因的BHK细胞株，为进一步研究新城疫病毒受体结合特性以及大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。

目前在我国用于预防新城疫病毒的疫苗全部为利用鸡胚生产的灭活疫苗，虽然在国内防控新城疫期间发挥了重要作用，但是，在禽流感疫苗销量较大的生产企业中，每天生产约需30万枚鸡胚，如此大的鸡胚需求量，势必无法保证鸡胚来源、品种一致，以及母源抗体水平、新鲜度一致，继而对鸡胚的孵化率及其所繁殖病毒的效价造成很大影响，由于这些自然因素，很难保证制备疫苗所用抗原的一致性，其结果就是疫苗批间的均一性大打折扣。而且鸡胚中含有大量的杂蛋白，使用过程中存在一定的安全隐患。另外，高压灭菌处理鸡胚废弃物，一是成本增加，二是由于量大，往往高压灭菌并不彻底，因此对环境也存在一定的安全隐患。所以，利用鸡胚培养很难保证每批产品质量均能达到一致，稳定，且安全。鸡胚源疫苗存在着质量难以控制、生产周期长、易引起过敏等问题，因此急需开发新的流感疫苗生产介质。

发明内容

本发明其主要目的是提供一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCR扩增ST3GALI片段：

以如下引物：

ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT3′。

以pESG-T-ST3GAL I质粒为模板，PCR扩增ST3GAL I基因序列，收集1000-1050bp的扩增引物；

(2)重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I的构建

将扩增序列连接到pMD18-T载体上得重组质粒pMD-ST3Gal I，使用Not I、Xba I分别双酶切pMD-ST3Ga I和pcDNA3.1-EGFP，酶切产物在T4DNA ligase的作用下连接，得重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I；

(3)BHK-21细胞的转染

BHK细胞在转染前一天接种，培养18～24h至70-90％细胞汇合，使用转染试剂将重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I转染BHK细胞；

(4)抗性细胞克隆的筛选