[发明专利]一种格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一组角环素（angucycline）抗生素，格瑞克霉素（grincamycin）和P-1894B(vineomycin A1)的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

格瑞克霉素和P-1894B是一类由角环素为骨架连接5个糖配基所组成的抗生素，具有很好的抗各种肿瘤细胞和革兰氏阳性细菌的活性，其结构式如图1所示。角环素是指通过聚酮生物合成途径形成十聚酮链而产生的具有角四环即苯并蒽环（Benz[a]anthracene）结构并不含糖配基的化合物。角环素类化合物分别于1965及1966年被Dann和Kunstmann and Mitscher等人首次报道过。微生物次级代谢产物生物合成是由多酶体系参与的，这些多酶体系中的各个酶系按照一定的组织结构协调起作用。聚酮化合物均是由多酶体系PKS催化酰基-CoA活化的底物之间的重复脱梭缩合而合成的。所有角环素类化合物都是由II型PKS形成的具有广泛生物活性及化学多样性的芳香多聚酮类化合物，其生物活性主要包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫调节等。由于角环素结构骨架及其糖配基数量和种类上的多样性，目前已发现天然的角环素类化合物总数超过170多个。目前有许多典型的角环素类型化合物的生物合成被报道，如：urdamycins,landomycins,gaudimycins,simocyclinone,oviedomycin。

角环素类天然产物在过去十几年里由于其显著的生物活性及多样的糖基团而引起了许多科学家的关注。除了从自然界中获得典型的天然角环素类化合物，通过组合生物合成的手段对角环素类化合物生物合成基因簇进行改造也已经获得一些新的具有显著生物活性的角环素类衍生化合物。另外，可以通过对化合物生物合成途径的了解，对一些化合物结构进行修饰，得到目标的化合物，或者通过对一些调控基因进行改造，可以达到提高目标化合物产量的目的。由于存在角环素化合物的毒性及可溶性问题，目前并没有该类化合物进入临床试验药物的报道，所以可以通过组合生物合成的手段，对该类化合物进行定向修饰，从而能够得到具有用药前景的角环素类化合物。

组合生物合成是近20年发展起来的一种合成天然产物结构多样性，用以发现和发展药物的新方法。它尤其适合于化学方法难以合成的那些复杂的生物大分子化合物。由于分子遗传工程、基因工程的发展，以及基因组学和蛋白质组学等学科研究的不断深入，诸多与微生物代谢相关的生物合成基因和蛋白功能被认知与掌握。通过生物信息学和微生物遗传学手段可确定基因簇中的各模块或结构域的功能，如将这些模块或结构域进行多种“自由”组合就可能产生核心环合成和功能基团各异的新型“非天然”天然产物。组合生物合成和代谢工程在筛选和发展新型药物方面日益成为生物、化学和医药界关注的重点。基于聚酮和聚肽类天然产物的独特化学结构和良好生物活性，研究它们的生物合成机制，将为合理化遗传修饰生物合成途径获得结构类似物提供遗传和生物化学的基础，实现利用现代生物学和化学的技术手段在微生物体内进行药物开发的目的。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇。

本发明的格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇来源于链霉菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32，其特征在于，该生物合成基因簇是从包含有整个格瑞克霉素和P-1894B生物合成基因簇的cosmid179F中测序获得的，该格瑞克霉素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3722～40612位的碱基序列所示，包含30个基因，具体为：

(1)负责格瑞克霉素和P-1894B的角环素骨架合成的基因，即gcnH、gcnI、gcnJ共3个基因：

gcnH位于基因簇核苷酸序列（SEQ ID NO.1，下同）第11220-12500个碱基处，长度为1281个碱基对，编码酮基合成酶，426个氨基酸；

gcnI位于基因簇核苷酸序列第12497-13717个碱基处，长度为1221个碱基对，编码II型PKS链延伸因子模块，406个氨基酸；

gcnJ位于基因簇核苷酸序列第13794-14063个碱基处，长度为270个碱基对，编码酰基载体蛋白，89个氨基酸；

(2)负责格瑞克霉素和P-1894B的角环素骨架后修饰的基因，即gcnA、gcnC、gcnF、gcnK、gcnL、gcnM、gcnP、gcnT、gcnU共9个基因：