[发明专利]基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法。

背景技术

流行性造血器官坏死病(Epizootic hematopoietic necrosis,EHN)是引起红鳍鲈、欧鲶、虹鳟和鮰鱼幼鱼和成鱼出现内脏坏死，以至死亡的一种鱼类传染病。流行性造血器官坏死病是由流行性造血器官坏死病毒（EHNV）引起的。EHN多在春季或早夏时发生，表征如下：鱼游动异常，有时沿螺旋游至水体表面；鳍条基部多出现出血点，头部发红，靠近骨骼的肌肉发白；肝脏处出现多个直径1-3mm的灰白色病灶；脾脏发红、肿大、呈凝胶状；鳃部充满杂质；有些患病成鱼在缥和肾脏处的腹膜严重充血。鉴于EHN的严重危害性，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为必须申报疫病之一。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的检测方法。

目前，EHNV的检测主要依靠免疫荧光、ELISA、聚合酶链式反应（PCR）和核酸杂交这几种技术。免疫荧光操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低。ELISA需要用进口检测试剂，进口试剂和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货，会严重影响检测进程。核酸杂交具有特异性强、敏感性高的优点，但相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。PCR比较快速、灵敏，但是需要进行琼脂糖凝胶电泳并通过溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法。

本发明提供了辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

本发明还提供了辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组合物。

本发明还提供了一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；如果所述PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的流行性造血器官坏死病毒；如果所述PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非流行性造血器官坏死病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为179bp。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。

本发明还提供了另一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增后与所述探针T1进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的流行性造血器官坏死病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非流行性造血器官坏死病毒。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。

所述辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法具体包括如下步骤（液相芯片法）：

（1）以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；

（2）制备微球悬液

①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75μL（约含3×10⁶个微球）置于1.5mL离心管中，10000g离心1min，弃上清；

②在步骤①的离心管中加入50μL0.1mol/L N-甲基咪唑水溶液（pH4.5），漩涡混合，超声波处理30-60秒（400W的功率,每超声9秒停6秒）；

③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针T1，漩涡混合；

④在步骤③的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法：将10mg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配）充分混匀，室温避光孵育30min；

⑤在步骤④的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法同上）充分混匀，室温避光孵育30min；

⑥在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，10000g离心1min，弃上清；