[发明专利]一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用。

背景技术

CpG基序（CpG motifs）是指含有非甲基化的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的核心序列的核苷酸。含有CpG基序的DNA序列称为CpG DNA，或CpG ODN（寡聚脱氧核苷酸，oligodeoxynucleotide），又称为免疫刺激序列。这类包含非甲基化的CpG二核苷酸的ODN在细菌、病毒基因组中的出现频率远高于在脊椎动物中出现频率，并且脊椎动物中80%胞嘧啶是甲基化的，这种显著的差异使脊椎动物可以识别入侵的细菌及病毒，因而CpG基序是哺乳动物免疫刺激信号的基础。人工合成的含有CpG基序的ODN序列可以模仿细菌DNA的刺激作用，激活多种免疫细胞产生多种细胞因子，调节免疫应答向Th1型转换。CpG ODN作为具有治疗性作用的DNA序列，在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病以及免疫佐剂等领域显示出广阔的应用前景。但CpG DNA自身易降解且细胞摄取率较低，因此需要很高剂量重复给药才能刺激机体产生有效的免疫应答，这极大的限制了它在医学领域的应用。

目前，常规的免疫刺激试剂为单链CpG寡聚脱氧核苷酸（ssCpG），但是ssCpG在体内易降解，所以注射剂量一般要达到毫克级才能起效果（徐娜，张雪梅，王钦富。增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展，中国医药生物技术，2012，7（2），144），致使实际应用中的成本很高。一种替代的试剂是含硫代磷酸酯骨架的寡聚核苷酸（S-CpG），该寡聚核苷酸具有硫代磷酸酯骨架，能有效抵抗核酸酶的降解，短时间内具有较好的免疫刺激效果，但是不能长时间保持免疫刺激活性，另外动物实验表明S-CpG具有较强的肾毒性（文献：Chavany C,Connell Y,Neckers L.Contribution of sequence andphosphorothioate content to inhibition of cell growth and adhesion caused by c-mycantisense oligomers.Mol Pharmacol1995;48:738–46.Crooke RM.In vitro toxicology and pharmacokinetics of antisense oligonucleotides.Anticancer Drug Des1991;6:609–46.）。

本世纪，纳米技术在医药领域的应用为解决上述问题提供了新的思路。纳米颗粒的小尺度效应使其很容易被细胞大量摄取，大的比表面积能够大量吸附并输运多种物质如药物，蛋白质，DNA等进入细胞，从而发挥生物学效应。现阶段，纳米颗粒被广泛用于各种药物输运系统的研制中，这其中，纳米金刚石（NDs）显示了独特的优势，首先，NDs通常由爆炸法制备而成，单颗粒直径约2-8nm，合成过程简单且成本较低。其次，NDs有很低的免疫原性和很好的体内外生物相容性。最重要的是，NDs在溶液中通常以自由能较小的团簇形式存在，团簇内部单颗粒之间和团簇表面都可以吸附大量药物分子，并且NDs在溶液中独特的团簇结构使得其上负载的物质能缓慢地释放，从而长时间发挥其生物学活性。因此，NDs是CpG DNA细胞内输运的理想载体。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有免疫刺激序列（CpG）自身易降解且细胞摄取率较低，需要很高剂量重复给药才能刺激机体产生有效的免疫应答的缺陷，提供一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用。发明人经过大量创造性劳动惊喜地发现，利用本发明所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物制备的免疫刺激缓释剂具有很高的细胞摄取效率，能够保护免疫刺激序列不被核酸酶降解，能够长时间地提高机体的免疫活性，具有良好的医学应用前景。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

（1）利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料，获得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料；

（2）将步骤（1）所得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料与免疫刺激序列混合于水溶液中，20℃～37℃，振荡0.5～3小时，离心收集沉淀，即得。

其中步骤（1）为：利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料，获得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料。