[发明专利]反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及筛选鉴定方法

权利要求书

1.一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：它是由菌株富集管、反硝化鉴定预制管、菌株保藏液组成；其中:

菌株富集管：

菌株富集管为装有富集培养基的螺口冻存管，其中每升富集培养基所含成分如下：牛肉膏1-3g，蛋白胨1-3g，葡萄糖0.8-2.1g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.7-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙20-50mg，碳酸氢钠20-120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7.00-7.50；富集培养基配制完成并调完pH后，将富集培养基分装到1.8ml螺口冻存管中，每支冻存管加入富集培养基1ml，分装完毕后，115℃灭菌25-30min；

反硝化鉴定预制管：

反硝化鉴定预制管中装有反硝化鉴定培养基，每升反硝化鉴定培养基所含成分如下：牛肉膏0.1-0.5g，蛋白胨0.1-0.5g，琥珀酸钠1-3g，醋酸钠0.1-0.8g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.5-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙5-50mg，EDTA二钠10-100mg，硝酸钾1-2g，亚硝酸钠0.1-1g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上培养基用浓度10%的氢氧化钠和HCl调pH至7.00-7.50；反硝化鉴定培养基配制完成并调完pH后，将反硝化鉴定培养基分装到反硝化鉴定预制管中，115℃灭菌25-30min；

菌株保藏液：

菌株保藏液成分如下：甘油40-60ml，去离子水40-60ml；，115℃灭菌25-30min；

其中：

每升微量元素母液A所含成分如下：硫酸亚铁5g，EDTA二钠5g；

其中：

每升微量元素母液B所含成分如下： EDTA二钠1.5g，ZnSO₄.7H₂O 430mg，CoCl₂.6H₂O 240mg，MnCl₂ 629mg，CuSO₄.5H₂O 250mg，Na₂MoO₄.2H₂O 220mg，NiCl₂.6H₂O 190 mg，H₃BO₃ 14mg。

2.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所说的反硝化鉴定预制管，包括鉴定管主体、气体收集管、支撑杆、密封盖和接种针头；所说的鉴定管主体的顶部设有顶部管口，顶部管口与气体收集管连接，所说的支撑杆自气体收集管的顶部插装于气体收集管内，支撑杆的底部与气体收集管的底部活动连接，鉴定管主体的底部设有底部管口，底部管口上安装密封盖，接种针头的末端设有连接帽，与鉴定管主体底部管口连接。

3.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的支撑杆的底部设有密封外螺纹，与气体收集管底部设置的密封内螺纹旋接。

4.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的气体收集管上设有刻度。

5.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的支撑杆的底部密封外螺纹上方套装密封橡胶垫。

6.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的支撑杆的顶部设有旋转手柄。

7.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的鉴定管主体与气体收集管为一体结构。

8.如权利要求2所述的一种反硝化鉴定预制管，其特征在于：所说的鉴定管主体、气体收集管、支撑杆和接种针头为PP或PE材料。

9.一种采用权利要求1反硝化细菌筛选鉴定试剂盒进行反硝化细菌筛选鉴定方法，其特征在于： 按如下的步骤进行：

步骤1：菌株富集

将待测菌样接种到菌株富集管中，将菌株富集管盖拧紧，培养条件选择28-35℃温度下静止培养24-48小时，或将菌株富集管平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；

步骤2：鉴定培养

将步骤1富集的菌株接种至反硝化鉴定预制管中，接种完毕后，在25-35℃条件下静止培养；

步骤3：菌种保藏

向菌株富集管中残留的菌液中加入0.5ml菌株保藏液，震荡混匀，放入-20℃冰箱保存；

步骤4：结果观察

步骤2的反硝化鉴定预制管中的菌株经培养12-48h后，记录管中培养基的颜色变化和产气量，此后，根据实验需要，每隔一段时间连续记录观察结果，培养基颜色由绿色变成蓝色并且有气体产生，为反硝化阳性细菌。