[发明专利]双水相体系萃取纯化金银花中的黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及双水相体系萃取纯化金银花中黄酮的新方法，特指以乙醇为萃取剂，以无机盐磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)作为分相的盐析剂，形成双水相体系（ATPS）萃取纯化金银花中黄酮的方法，属于双水相提取技术领域。 

背景技术

黄酮类化合物（Flavonoid）是指具有C6-C3-C6基本结构的天然产物，大部分为色原酮的衍生物，广泛存在于药用植物、水果、蔬菜和牧草当中，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。最初，这类物质的粗制品仅作为燃料使用，20世纪20年代以来，国外把槲皮素，芦丁用于临床药物后，才逐渐引起人们的关注。之后相继发现黄酮类化合物具有VC的活性和较强的抗油脂氧化能力。至80年代以后，对其研究又开始转向对活性氧自由基的清除以及对老年疾病的防治功能上，发现在生物体内黄酮类化合物具有显著的抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、防癌抗癌、抗衰老、预防心血管疾病、调节免疫和止血镇痛等功效。近年来，随着黄酮类化合物在食品，药品，化妆品等行业中的广泛应用，黄酮类化合物的独特功效将得到不断的发掘及应用。因此采用不同方法，从大自然中获取黄酮类化合物被各国政府，医药部门列为重要的研究热点，黄酮类化合物也日益成为天然药材，保健食品的一类功能因子而备受人们亲睐。 

金银花属忍冬科半常绿缠绕藤本植物，它的主要化学成份包括有机酸类，黄酮类，糖类，挥发油等化合物。金银花中含有黄酮类化合物：木犀草素-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷等。目前，传统的黄酮提取方法包括有机溶剂提取法、固相萃取法、超临界萃取法、超声波提取法。但是这些方法提取出来的黄酮杂质多，纯度低，产品的商业价值小。因此，需要建立一种高效、无毒、无污染的绿色萃取纯化方法。 

双水相体系是一类新型萃取分离体系，它是由两种聚合物或一种聚合物和一种盐的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系，具有无毒、无污染、萃取条件温和、样品易分离、操作简单等优点。与传统的双水相萃取体系相比，功能性聚合物-盐双水相体系使用的温敏性聚合物成本低且易于温度分离回收，分相时间短，萃取组分可以循环利用，达到绿色化学的目的。 

1955年由Albertson首先利用双水相技术来分离生物分子，在随后的几十年中，这项技术有了长足的发展。近几年来，双水相技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了显著的成绩。由于其操作条件温和、有机溶剂用量少、可调节 因素多及易于工业化放大和操作等，广泛用于物质的提取和分离富集。 

发明内容

本发明建立了一种全新的提取金银花中黄酮方法—小分子醇类/盐双水相体系(ATPS)。该方法将小分子醇类乙醇与盐两相混合，它利用了目标物和杂质在水相和有机相中的溶解能力不同，在成相条件改变的条件下，目标物分配在上相，糖类等杂质分配在下相，实现目标物选择性分离，从而达到纯化的目的。这种新型的分离体系集双水相萃取优点，同时由于小分子醇类易挥发回收这一性质，实现了分离纯化目标物的目的。 

本发明采用的技术方案是： 

小分子醇类双水相体系萃取纯化金银花中的黄酮，是以低成本的无毒的乙醇作为萃取溶剂，以磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)作为盐析剂对金银花中黄酮进行萃取纯化的方法。 

本发明具体步骤： 

（1）在磨口离心管中，加入磷酸二氢钠溶液，乙醇以及用石油醚脱脂后的金银花粉末; 

（2）用紫外-可见分光光度法在波长510nm处和490nm处分别分析测定上下相中的黄酮和糖的含量； 

（3）用响应曲面Box-behnken design(BBD)优选出萃取的最佳条件,并在优化的实验条件下进行二级萃取，进一步纯化产物； 

（4）对上下相分别进行旋转蒸发和重结晶，回收乙醇和盐。 

其中步骤（1）中磷酸二氢钠溶液和乙醇的体积比为1:3， 

其中步骤（1）中金银花粉末与磷酸二氢钠溶液和乙醇的混合溶液的质量与体积比为总体积0.1：10(g/ml)； 

其中步骤（3）萃取的最佳条件为石油醚脱脂后的金银花粉末0.1g;4.66g磷酸二氢钠，36%乙醇（V/V）,pH5.0。 

本方法具有提取率，选择性好、无毒、分离效果好、成本低，且具有设备简单、灵敏度高、测量快速、提取物后处理简便、相组分可以回收及循环利用等特点。 

附图说明