[发明专利]一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域的，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法，即用于同时扩增H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M三个全长基因的寡核苷酸引物组及使用该引物组的多重扩增方法。 

背景技术

禽流感是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类的一种以呼吸系统症状为主的禽类传染病。其中H9N2亚型低致病性禽流感病毒虽不及H5亚型禽流感病毒的致病力强，但由于其临床的分离率较高，且具有致病力变强造成免疫失败的趋势，所以，H9N2亚型禽流感病毒给养禽业带来的危害也不容忽视。 

禽流感病毒基因组由8个负链单链RNA片段组成，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因，这种核酸的多段性易使抗原性发生突变而不断变异，使得H9N2低致病性禽流感的致病力也随之变异。血凝素（HA）是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，在病毒吸附和穿膜过程中以及决定病毒致病力方面起着关键作用。神经氨酸酶（NA）是构成病毒囊膜纤突的另一部分。研究HA、NA基因发生的突变对掌握H9N2亚型禽流感病毒变异情况至关重要。基质蛋白（M）位于病毒囊膜的类脂双层内侧，核衣壳外侧，是维持病毒形态的结构蛋白，具有特异性，其抗原性的差异也是流感病毒分型依据之一。 

常规禽流感序列分析需对各个基因分别反转录和PCR扩增，若对大量毒株进行分析时用普通PCR方法扩增全基因则既花费大量时间，又耗费实验材料。因此，建立一种能同时扩增H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M三个全长基因的多重PCR方法具有重要的应用上的价值。 

而且目前多重RT-PCR方法均应用于禽流感病毒的检测或者分型，扩增出的目的片段仅是目的基因的一部分基因片段。 

发明内容

本发明的目的是提供一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法，可快速同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因，从而弥补现有技术的不足。 

本发明首先提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2-7。 

本发明还提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全 长基因的方法，包括如下的步骤： 

1）病原RNA的提取 

取H9N2亚型禽流感病毒感染的阳性鸡胚尿囊液400μL，加入600μL细胞裂解液和400μL氯仿，颠倒混匀后，-20℃沉淀10min，15,000g离心10min；取上清加入到750μL异丙醇中，颠倒混匀，-20℃沉淀30min，15,000g离心10min；弃去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，弃去上清液，并吸干残余液体； 

2）反转录 

采用20μL的反转录体系：5×RT buffer4μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，200U/μL M-MLV反转录酶 0.5μL，25μmol/L的通用反转录引物1.5μL，用DEPC水补足体积至20μL，42℃水浴1小时； 

3）多重RT-PCR扩增HA、NA、M全长基因 

采用总体积为30μL的多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，2.5mmol/L的dNTPs 5μL，Taq酶 0.5μL，基因上下游引物各0.5μL，RT产物2μL，用DEPC水补足至30μL，混匀离心后进行PCR，循环条件为94℃预变性 5min后，94℃变性30S，60℃退火40S，72℃延伸90S，共循环30次，最后72℃终延伸10min完成扩增。 

经1%琼脂糖凝胶电泳可见三个目的条带，其中HA全长基因扩增出1742bp的特异性条带，NA全长基因扩增出1410bp的特异性条带，M全长基因扩增出1027bp的特异性条带。 

本发明的引物组及建立的多重扩增方法可在一个反应中将三个基因同时扩增出来，且设计的多重引物在多重PCR反应中无非特异性扩增，具有很好的应用价值。  

附图说明

图1 ：本发明方法的扩增结果的电泳图； 

其中1、Marker DL2000  2、H9N2禽流感病毒； 

图2 ：本发明方法的特异性试验电泳图，