[发明专利]快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器技术，具体涉及一种快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器及其制备方法。 

背景技术

临床上疾病的早期诊断对提高疾病治愈的可能性具有至关重要的作用，这给各种疾病标记物的分析方法带来一定的挑战，同时也促进了检测疾病标志物传感器研究的快速发展。电化学发光是指物质在电极上经历了高能量的电子转移反应从而形成激发态来发射出光的一种电化学反应，其综合了电化学与光学的双重优点，近年来已逐渐发展为一种应用于生物医学检测等诸多领域的新型分析测试方法。电化学发光免疫传感器也因其操作简单、灵敏度高、检测迅速和背景噪音低等优点而成为近几年的研究热点。特别在检测DNA杂交物、基因点突变、端粒酶活性、蛋白质等物质上取得了显著效果。双抗夹心型的电化学发光免疫传感器是基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器，指某种蛋白有选择性的被其对应的抗体捕获后又与其二抗结合，之后将这个夹心体系与分子探针结合修饰到电极上，通过一定的电化学发光表征手段来间接检测蛋白的量。常用来标记二抗的探针有酶、荧光染料、电化学发光试剂（三联吡啶钌）、电活性物质， 纳米粒子等。目前，很多研究都尝试直接用三联吡啶钌（Ru（bpy）₃²⁺）类的化合物标记DNA和蛋白质，主要源于钌类化合物卓越的发光性能、良好的水溶性和生物相容性。但这种方法存在一定的局限性，因钌类化合物与蛋白质或DNA等的结合率不高，导致大多数这类免疫传感器的信号不够强，故其检测的线性范围较窄，且检测限低，因而难以应用于实际样品的检测中。本发明成功地构建了一种双重信号放大型蛋白质的电化学发光免疫分析方法，首先利用SiO₂大的比表面积和表面多而规则的孔结构，再结合Nafion膜较好的阳离子交换性能来吸附大量的Ru（bpy）₃²⁺，合成钌参杂的SiO₂纳米粒子，由视黄醇结合蛋白（RBP）单抗分子标记的此复合纳米粒子探针构建的电化学发光免疫传感器与三丙胺（TPA）溶液可产生强烈的光强。另外，通过多壁碳纳米管（MWCNTs）与玻碳电极（GCE）间稳定的π-π键结合，将兼具导电性能佳、比表面积大的多壁碳纳米管固定到玻碳电极表面，一方面可以通过活化的多壁碳纳米管的羧基与抗体氨基间的酰胺反应将大量的RBP一抗固定于电极表面，另一方面多壁碳纳米管可作为再次信号放大的基质材料，极大地提高了免疫传感器的灵敏度和检测的线性范围。 

视黄醇结合蛋白（RBP）是一种广泛存在于人体血液、尿液、脑脊液和其他体液内的低分子量蛋白质，其具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。现认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、 肝脏及营养性疾病发展、转归的敏感指标。尿液中RBP的检测可作为肝功能早期损害和监护治疗的重要指标，从而有效地防止由肝功能的损坏引起的糖尿病和高血压等疾病的发生率。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器，探索一种简便、快捷、灵敏的检测体液中RBP含量的新方法，为基于双抗夹心法的电化学发光免疫传感器在疾病标志物的检测方面的应用提供依据。 

本发明的技术方案如下： 

一种快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器，其特征在于，包括玻碳电极，玻碳电极表面修饰有一层多壁碳纳米管膜，多壁碳纳米管膜上依次修饰有RBP一抗、BSTA、RBP抗原和RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子。 

所述RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子是以SiO₂纳米粒子为核心，表面包覆Nafion膜，Nafion膜上吸附有Ru（bpy）₃²⁺，最外层标记RBP二抗的复合纳米粒子。 

其制备方法包括以下步骤： 

1）将SiO₂纳米粒子分散于Nafion-乙醇溶液中，冰浴中搅拌3-4小时，4℃下离心分离，获得Nafion包覆的SiO₂，记为NafionSiO₂；SiO₂纳米粒子与Nafion的质量比优选为1:20-25；