[发明专利]Line-1基因甲基化定量检测方法

权利要求书

1.一种Line-1基因甲基化定量检测方法，具有如下步骤：

①对待测样本进行处理，得到样本模板；

②设计并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；

③分别用步骤②的甲基化引物和未甲基化引物对步骤①的样本模板进行PCR扩增反应，并分别得到相应的PCR扩增产物；

④分别对步骤③得到的PCR扩增产物进行处理，并分别得到相应的标准品模板；

⑤分别对步骤①的样本模板以及步骤④的标准品模板进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度；

其特征在于：

步骤②中所述的Line-1基因甲基化引物如下：

Line-1基因甲基化正向引物：CGCGAGTCGAAGTAGGGC；

Line-1基因甲基化反向引物：ACCCGATTTTCCAAATACGACCG；

扩增片段长度为110bp；

步骤②中所述的Line-1基因未甲基化引物如下：

Line-1基因未甲基化正向引物：TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT；

Line-1基因未甲基化反向引物：ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA；

扩增片段长度为110bp。

2.根据权利要求1所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤①中所述的对待测样本进行处理包括：

A、从待测样本中提取DNA；

B、对提取的DNA进行亚硫酸氢钠修饰；

C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板。

3.根据权利要求2所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：所述的待测样本包括组织、血液、体液、分泌物或者穿刺物。

4.根据权利要求1所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤③中所述的PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环。

5.根据权利要求1或4所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤③中所述的PCR扩增反应的反应体系为：

2.5μL不含MgC1₂的10xPCR buffer；

2.0μL浓度为25mM的MgC1₂；

2.0μL浓度为2.5mM的dNTP；

0.5μL浓度为5IU/μL的Taq酶；

0.5μL浓度为20μM的正向引物；

0.5μL浓度为20μM的反向引物；

1.0μL的样本模板；

16μL的H₂O。

6.根据权利要求1所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤④中所述的对PCR扩增产物进行处理具体过程如下：先将PCR扩增产物进行纯化并连接入pMD18-TVector；然后电击法转化至大肠杆菌的DH5α工程菌；接着挑选出重组克隆菌进行菌液DNA测序；最后对测序正确的重组克隆菌进行扩增、抽提，得到标准品模板。

7.根据权利要求1所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤⑤中所述的实时荧光定量PCR检测的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，40个循环。

8.根据权利要求1或7所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤⑤中所述的PCR扩增反应的反应体系为：

10μL的SYBR-PCR反应液；

0.5μL的正向引物；

0.5μL的反向引物；

1.0μL的模板；

8μL的H₂O。

9.根据权利要求1或7所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤⑤中所述的甲基化程度的计算方法为：以标准品的拷贝数的对数为横坐标，检测得到的标准品的循环数为纵坐标，分别制作Line-1基因甲基化标准品标准曲线和Line-1基因未甲基化标准品标准曲线；由制作的标准曲线的斜率和截距以及检测得到的待测样本的循环数计算出待测样本的Line-1基因甲基化的拷贝数M和Line-1基因甲基化的拷贝数U；M/（M+U）即为Line-1基因甲基化程度的定量值。

10.根据权利要求8所述的Line-1基因甲基化定量检测方法，其特征在于：步骤⑤中所述的甲基化程度的计算方法为：以标准品的拷贝数的对数为横坐标，检测得到的标准品的循环数为纵坐标，分别制作Line-1基因甲基化标准品标准曲线和Line-1基因未甲基化标准品标准曲线；由制作的标准曲线的斜率和截距以及检测得到的待测样本的循环数计算出待测样本的Line-1基因甲基化的拷贝数M和Line-1基因甲基化的拷贝数U；M/（M+U）即为Line-1基因甲基化程度的定量值。