[发明专利]一种角膜中期保存液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种角膜中期保存液及其制备方法。

背景技术

角膜保存是眼库的重要技术之一，分为活性和非活性保存两种，活性保存根据角膜内皮细胞活性的保存时间分为短期、中期、长期3种保存。短期保存是将全眼球消毒无菌处理后湿房4℃保存24小时。中期保存一般采用角膜片组织营养液4℃保存，目前世界范围内最常使用Dexsol、Optisol和Optisol-GS，保存时间可达14天。长期保存方法有器官培养法和超低温冷冻保存法。1965年，Capella和Kaufman用超低温保存法有效地延长了角膜保存的时间最长至1年，但由于设备复杂，操作麻烦，故难以推广。器官培养法保存角膜用于临床角膜移植一般在保存4周内、最长保存至7周。但由于方法复杂，所需设备昂贵，一般眼库和基层医院难于开展此项工作。

鉴于短期保存的保存时间过于短暂以及长期保存法的不易推广应用，角膜保存液研制的热点集中于中期保存液。目前国际上最常用的Dexsol和Optisol虽然在保持角膜内皮细胞活性方面功能显著，但价格昂贵，不适合我国国情。根据我国角膜供体材料来源严重匮乏，又缺少足够数量的正规眼库，因此，研制理想的新型角膜中期保存液以最大限度的利用有限的供体材料是亟待解决的研究课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种角膜中期保存液及其制备方法。

本发明所提供的一种角膜中期保存液，以1000mL计，所述中期保存液的组成如下：

低限量基础培养基 4～5克，组织培养基199 4～5克，

低分子右旋糖酐 10～20克，硫酸软骨素 20～30克，

丙酮酸钠 100～150毫克，HEPES 3～4克，

小牛血清 20～40毫升，非必需氨基酸 10～20毫升，

硫酸庆大霉素 1～2毫升，碱性成纤维细胞生长因子 100～200微升，和

余量的双蒸水。

以1000mL计，所述中期保存液的组成具体可为：

上述的角膜中期保存液中，所述非必需氨基酸具体可为美国生命技术公司提供的商品目录号为11140-050的氨基酸，其组成和配方如表1中所示。

表1非必需氨基酸的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述低限量基础培养基具体可为美国Invitrogen生命技术公司提供的商品目录号为41500018的基础培养基，其组成和配方如表2中所示。

表2低限量基础培养基的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述组织培养基199具体可为Sigma公司提供的商品目录号为M0393-10的组织培养基，其组成和配方如表3中所示。

表3组织培养基的组成和配方

上述的角膜中期保存液中，所述中期保存液的pH值可为7.2～7.6，渗透压可为330～390mOsm/Kg，可在2～8℃保存；该角膜中期保存液在温度为4℃保存角膜材料时，保存时间可达14天。

本发明还提供了上述中期保存液的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所述低限量基础培养基、基础培养基199、低分子右旋糖酐、硫酸软骨素、丙酮酸钠和HEPES溶于所述双蒸水中，经除菌后得到基础液；

（2）将所述小牛血清、非必需氨基酸、硫酸庆大霉素和碱性成纤维细胞生长因子加入至所述基础液中得到全液，即为所述角膜中期保存液。

本发明提供的角膜中期保存液是一种新型的角膜保存基质，因其含有较高的硫酸软骨素，故其保存的角膜水肿较轻。另外，硫酸软骨素除了高渗作用外，还具有稳定细胞膜的作用。并且，改进的保存液含有Hepes平衡系统，以使保存液PH值更趋稳定。角膜中期保存液中添加碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），具有促进角膜细胞损伤的修复，细胞形态的重建，调节细胞膜表面各种整合素的表达，促进内皮细胞的黏附生长，刺激内皮细胞的增殖等作用，对中期保存角膜有减少细胞凋亡和维持细胞形态及活性的作用。

附图说明

图1为在接种有绿脓杆菌的培养皿中，实施例4中角膜中期保存液培养24h后绿脓杆菌的抑菌环直径，其中A表示本发明的角膜中期保存液，B为庆大溶液。