[发明专利]一种提取铁皮石斛RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA的提取方法，尤其涉及到一种利用改良CTAB法与Trizol法相结合提取铁皮石斛RNA的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生草本植物,2010年版《中国药典》单独收载，具有独特的药用价值，为石斛之极品。在研究铁皮石斛遗传学基础中，RNA的提取是一项基础性的工作。目前国内外提取RNA通常采用CTAB法进行：提取材料中加入CTAB提取液后充分裂解，离心之后，取其上清液先用氯仿异戊醇抽提2~3次，去除蛋白及一些色素及杂质；然后取上清液，加入四分之一体积10 M LiCl 4 ℃过夜沉淀，沉淀完之后用SSTE溶解，然后再用无水乙醇沉淀最终得到RNA。由于铁皮石斛多糖含量很高，普通的CTAB法中，少量的LiCl不能充分沉淀RNA，另外氯仿异戊醇主要作用是去蛋白，而铁皮石斛蛋白含量很低，在加入CTAB提取液充分裂解后加入氯仿异戊醇抽提2~3次不仅没有必要，而且可造成RNA的大量损失。因此，用现有的CTAB 法提取铁皮石斛RNA效率比较低，且所获得的RNA的纯度也不高。

发明内容

本发明提供的是一种高效提取铁皮石斛的RNA的方法，将改良的CTAB法与Trizol法结合，可以提取高质量的铁皮石斛RNA，然后进行转录组测序，以便于铁皮石斛在分子领域中的后续研究。

本发明是通过下述方式实现的：一种提取铁皮石斛RNA的方法，包括下述过程：

用液氮冷却研钵将铁皮石斛幼嫩叶片研磨，充分研磨后，立即加入到预热好的CTAB提取缓冲液中，均匀摇动；

将铁皮石斛组织与提取液混合物置于65℃水浴条件下20 min后，冷却至室温，4 ℃，12000 rpm离心10 min；

其特征在于：所述的铁皮石斛组织与提取液混合物经离心后的上清液，以等量的10 M LiCl混合，溶液在4 ℃条件静置8-12小时，4 ℃条件下，12000 rpm离心20 min；

弃上清液，用75%乙醇清洗沉淀，在4 ℃条件下，12000 rpm离心5 min，弃上清液；

用SSTE溶解沉淀，然后加入Trizol，摇匀后加入氯仿，4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；

取上清液，加入与上清液等体积氯仿与异戊醇的混合液，其中氯仿：异戊醇按24：1比例配合，在4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；

取上清液，加与上清液等体积异丙醇，-20 ℃沉淀至少20 min， 4 ℃条件下，12000 rpm离心10 min；

弃上清液，用75%乙醇清洗沉淀，连续洗涤两次，干燥沉淀，得纯铁皮石斛RNA。

由于本发明通过对现有的CTAB法进行改良，加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等体积高浓度LiCl进行RNA沉淀，并同时利用高浓度LiCl去掉分离液中的多糖，不仅最大程度保留了RNA，同时也去除了大部分多糖，提高了RNA纯度。

附图说明

图1 为本发明的工艺流程图

图2为样本78×72用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图；

图3为样本78×72以用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图；

图4为样本A39用本发明方法提取总RNA凝胶电泳图；

图5为样本A39用CTAB法提取总RNA凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例：

一、材料准备：

试验所用的铁皮石斛种植于浙江农林大学遗传学科实验基地，本实验选用两种种质：78×72（多糖含量较高）和A39（多糖含量较低），采集其幼嫩叶片，于液氮中快速冷冻后保存于-70℃的超低温冰箱备用.

CTAB溶液：2% CTAB，2% PVP，100 mmol·L^-1 Tris-HCL(PH 8.0),25 mmol·L^-1 EDTA,2.0 mol·L^-1 NaCl。

SSTE：1.0 mol·L^-1 NaCl,0.5% SDS,1 mmol·L^-1 EDTA(PH 8.0),10 mmol·L^-1 Tris-HCl(PH 8.0)。Trizol（RNAiso Plus(D9108B)）为Takara公司产品，琼脂糖为Promega 公司产品，其他试剂均为分析纯。