[发明专利]一种用于CHO细胞表达可溶性重组人透明质酸酶PH20的基因序列

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）重组表达可溶性透明质酸酶的基因序列和含有该基因的工程细胞株。

背景技术

透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，透明质酸是胞外基质的必需组分以及间质屏障的主要成分。透明质酸酶能使透明质酸产生低分子化作用，从而降低透明质酸的活性和粘度，提高组织中液体渗透能力。

透明质酸酶家族包括细菌透明质酸酶，来自寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶和来自哺乳动物的透明质酸酶。而人的基因组中有6个类透明质酸酶基因：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。其中，HYAL3、HYAL4呈现出没有或很少的降解透明质酸活性，而HYAL1、HYAL2是酸活性透明质酸酶，在中性pH条件下一般缺乏催化活性，PH20是中性活性酶，在人体的血液或组织液的pH范围内具有催化活性。

透明质酸酶主要用来改善其他注射用药物的渗透和增加其他药物的组织渗透性和促进扩散或分散。最常见的应用是眼科手术和局部麻醉药物的快速渗透（如牙科），小儿静脉点滴中无法找到血管时使用。还可用于治疗肿瘤，与昂贵的抗体配合皮下注射代替静脉点滴，保持胰岛素和其它泵给药的通畅等用途。由于来源于动物组织中提取的透明质酸酶免疫原性较强，不适于运用于人体临床，利用基因工程重组技术表达、生产人透明质酸酶已成为必然的趋势。由于人全长PH20氨基酸序列的 C端含有糖基磷脂酰肌醇（GPI）修饰位点，影响了其向宿主细胞外的可溶性分泌，故构建可溶性PH20分泌表达株时要去掉PH20前体蛋白（precursor）氨基酸序列C端对应的编码序列，而留下PH20 前体蛋白中1-482位氨基酸对应的编码序列。表达的蛋白称为可溶性重组人PH20蛋白（soluble rHuPH20）。如美国FDA批准上市的Hylenex透明质酸酶，即是soluble rHuPH20 。

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是一种来源于中国仓鼠卵巢的纤维母细胞，是哺乳动物表达系统常用的宿主细胞。它具有很多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，表达产物细胞外分泌，便于分离纯化，而且由于其属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利用外源蛋白的分离纯化。

    我们在研究中发现，用含可溶性rHuPH20天然基因序列的载体转染遗传工程改造的CHO细胞株（具体为DG44细胞株）而构建的工程细胞株表达PH20的水平较低，导致生产成本高昂。我们对天然序列优化后的基因序列能大大提高目的蛋白在CHO细胞株中的表达水平。

发明内容

本发明的目的在于：针对编码可溶性rHuPH20的天然基因低表达的缺陷，通过优化基因序列，实现可溶性rHuPH20在CHO工程细胞株中的高表达。

本发明所采取的技术方案是：

优化的人透明质酸酶PH20的基因序列，其具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在上述人透明质酸酶PH20优化基因序列5’端添加kozak共有序列，得到其衍生的DNA序列

一种克隆载体，含有上述人透明质酸酶PH20优化基因序列或者由其衍生DNA序列。

一种表达载体，含有上述人透明质酸酶PH20优化基因序列或者由其衍生DNA序列。

所述表达载体的起始载体为哺乳动物细胞表达载体。

一种中国仓鼠卵巢细胞表达株，含有上述的表达载体。

所述的中国仓鼠卵巢细胞表达株为DHFR基因缺陷型。

上述中国仓鼠卵巢细胞表达株在生产可溶性重组人透明质酸酶PH20上的应用。

本发明的有益效果是：本发明经优化后的PH20的基因序列，连接到pOptiVEC-TOPO载体完成质粒构建，稳定转染到遗传工程改造的中国仓鼠卵巢细胞后，与原序列相比能显著提高可溶性重组人透明质酸酶PH20（soluble rHuPH20）的表达水平。

附图说明

图1为本发明优化的可溶性rHuPH20基因序列与天然基因序列编码的氨基酸序列对比分析；

图2为pOptiVEC-TOPO载体结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

由于下面的操作中将涉及透明质酸酶活性的检测和PH20基因拷贝数的定量，所以这里先介绍一下这两种方法的操作。

一、透明质酸酶的活性检测方法（浊度法）