[发明专利]RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。

背景技术

卷烟是一种特殊的深加工食品，而加工程度越深，DNA的提取难度就越大。成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝，不但增加了DNA提取过程中的污染物，还使基因组DNA严重降解，成为小于1000bp的小片段。因而卷烟烟丝不能提取得到完整的基因组DNA。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。

1990年，美国Dr.Williams等人第一次建立了用任意顺序的10个碱基的寡核苷酸片段作为单引物，用未知序列的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段，此多态性检测技术被命名为随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD）。RAPD可用来构建一系列的遗传图谱作基因连锁分析，以及品种鉴定等，RAPD是以孟德尔方式遗传。自从RAPD技术建立以来，在RAPD标记应用中，人们关注RAPD标记的核心是它的可重复性问题，其次是扩增产物量的问题，这两个问题都会影响分析的准确性。在RAPD技术中，DNA提取方法、反应体系实验操作技术和方法等因素都会影响RAPD结果稳定性。

目前，国内外关于烟草DNA的提取技术研究和RAPD分析都是基于新鲜烟叶或者复烤烟叶，而对成品卷烟烟丝的DNA提取技术研究，鲜见报道。而大部分DNA提取技术应用于成品烟烟丝时，得到的DNA浓度较小，一次RAPD扩增不能得到清晰稳定的图谱。因此，提供一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种RAPD-PCR试剂盒、扩增方法及其应用。以成品卷烟烟丝总DNA为模板，该试剂盒通过二次RAPD-PCR获得的扩增产物电泳图谱清晰，为后续研究奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种RAPD-PCR试剂盒，包括Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。

本发明还提供了上述试剂盒在扩增成品卷烟烟丝总DNA中的应用；本发明提供的RAPD-PCR试剂盒，包括Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。

本发明还提供了一种成品卷烟中烟丝总DNA的扩增方法，包括如下步骤：

步骤1：获得成品卷烟烟丝总DNA；

步骤2：取成品卷烟烟丝总DNA经第一RAPD-PCR，获得第一扩增扩产物；

步骤3：取第一扩增产物稀释后经第二RAPD-PCR，获得第二扩增产物；

第一RAPD-PCR的反应体系为成品卷烟烟丝总DNA5ng～80ng、Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U；

第二RAPD-PCR的反应体系为第一扩增产物5ng～80ng、Mg²⁺1.50mM～3.00mM、dNTP0.10mM～0.20mM、随机引物0.20μM～0.35μM、10×Buffer2μL、Taq酶0.5U～1.25U。

在本发明的一些实施例中，第一RAPD-PCR或第二RAPD-PCR的扩增程序包括：

预变性94～95℃，5～7min；

变性94～95℃，45～65s；

退火37～40℃，30～40s；

延伸72℃，90～100s；

终延伸72℃，5～6min；

30～40个循环。

在本发明的一些实施例中，步骤2与步骤3之间还包括取第一扩增扩产物第一电泳的步骤。

作为优选，第一电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。

作为优选，稀释的倍数为10～50倍。

在本发明的另一些实施例中，第二RAPD-PCR后还包括取第二扩增扩产物经第二电泳的步骤。

作为优选，第二电泳采用的琼脂糖凝胶的浓度为2～3%。