[发明专利]全自动细胞非染色图像识别计数方法

说明书

  技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其涉及一种检测细胞数量和活性的全自动细胞非染色图像识别计数方法。

背景技术

由于细胞在培养时必须保持一定的浓度才能有较好的活性，因此在细胞的复苏、培养、冻存过程中需要根据实际情况多次进行细胞计数；目前，常用的细胞计数方法包括自动图像识别法和电阻抗计数法。

电阻抗计数法是：以检测电解质溶液中悬浮的细胞在通过计数通道时引起的电阻变化为基础，进行细胞计数和体积的测定，这种方法称为电阻抗法，也称为库尔特原理。

电阻抗法缺点：1、由于电阻抗法中的小孔管的内径仅有25μm，因此目前采用电阻抗的仪器均无法对直径大于25μm的细胞比如人类的卵细胞直径达100μm进行计数，2、细胞碎片形成的团块、稀释液中的杂质团块以及双联体细胞或多个细胞聚集，均会影响细胞计数的准确性，3、细胞的计数信号和干扰信号在放大过程中同时被放大，极大的影响了结果的可靠性；4、为了使仪器能准确甄别细胞，仪器需要进行经常性的质控，设定阈值，操作繁琐；5、同时检测电场的存在，对细胞的活性以及将来的再培养也会产生不良影响。

图像识别法原理是：根据存活状态的细胞，细胞膜完整，染色剂台盼蓝不能穿透活细胞的细胞膜，只能使细胞膜染色但细胞内部结构不能被染色。而死亡后的细胞，其细胞膜失去完整性，台盼蓝就能穿过死细胞的细胞膜，使细胞胞浆和核碎裂后散在于胞浆内的细胞核被染成蓝色，从而得以间接鉴别细胞的存活或死亡状态。在显微镜下，活细胞成像特征是：染色后的细胞，细胞膜周围有一圈蓝色，细胞中心区域透亮，呈现为一透亮的圆环状；死细胞的图像则呈现为可以与背景颜色区别开来的蓝色的圆形或椭圆形斑点。通过光学系统将细胞计数板上已知样本体积的特定区域的细胞图像放大，应用计算机图像识别软件通过图形抓取，分析图像的圆度、直径、颜色灰度等参数，能全自动计算出计数板中活细胞浓度（数量/毫升）、死细胞浓度（数量/毫升）、细胞总数（含死细胞和活细胞）值，活细胞比例等数据，并能存储到仪器内或通过U盘等转移到其他计算机存储介质。

但图像识别法的缺点：1、此类方法中常用的染料均为核染料，对活细胞有一定的毒性；2、只能实现离线计数，细胞必须脱离培养体系方能计数，不能实现实时在线计数即不脱离培养体系；3、对于胚胎细胞需要后续培养增殖的细胞是不能使用的。4、无法判断具有内吞功能细胞的活性及数量，以及处于细胞凋亡过程中后期的细胞，此时细胞已经进入不可逆的死亡程序，但仍拒染台盼蓝。因此传统的细胞经染色后再进行图像识别的细胞计数法存在较大的局限性。

发明内容

为了解决传统的细胞经染色后再进行图像识别的细胞计数法存在的对活细胞产生毒性、无法在线计数、对染色后的胚胎细胞无法进行后续培养增殖以及无法判断具有内吞功能细胞的活性及数量的问题，本发明的目的是提供一种全自动细胞非染色图像识别计数方法，该方法避免使用台盼蓝带来的潜在毒性，不仅能对各种大小细胞进行活性计数，而且能对无法用台盼蓝染色的细胞如生殖细胞、胚胎细胞进行活性计数，同时也能方便的实现准确在线计数。

本发明的技术方案是以下述方式实现的：

一种全自动细胞非染色图像识别计数方法，该方法选择图像识别法全自动细胞计数仪，该计数仪结构包括点光源、凸透镜、计数片、调焦物镜、滤光片、感光芯片、数据线、控制器、图像识软件、显示器；

操作步骤如下：

用移液器取待测细胞悬液，直接加入计数片中并插入计数仪；

打开感光芯片的参数设置；

先做白平衡，记录白平衡后的所有参数值，将这些参数值作为基本值；

降低红光R增益、绿光G增益，即降低感光芯片对红光R、绿光G光强的接收能力，此时仪器已经调至最佳值并设为默认值；

增大蓝光B的增益，即增强了感光芯片对蓝光B光强的接收能力，增大幅度为基本值的1至2倍，此时计数仪已经调至最佳值并设为默认值；

此时显示器背景为浅蓝色，点光源发出的光经凸透镜、计数片、调焦物镜、滤色片、感光芯片将光信号转换成电信号，并经数据线传输到控制器，最终在显示器上显示的背景为浅蓝色，此时仪器已经调至最佳值并设为默认值；

此时计数仪光路中的滤光片阻止了红光R、绿光G光的干扰，只允许蓝光B光通过，这时活细胞反射的蓝光B光强度大于死细胞反射的蓝光B光强度；