[发明专利]人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是用基因工程方法生产一种能够快速中和血浆中脑钠肽成分的基因工程抗体及其制备方法，及其在脑性盐耗综合征治疗中的应用。

背景技术

脑性盐耗综合征(cerebral salt wasting syndrome，CSWS)是颅脑疾病常并发的一种严重危害患者生命健康的临床综合征，主要表现为：低血钠、高尿钠和低血容量，其发病率较高，尤其是在重度颅脑外伤和各种原因所致的蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)患者中发病率更高。研究表明，CSWS的发病为中枢神经系统通过分泌脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)影响肾脏对钠的重吸收而引起。

血液循环中的BNP为含32个氨基酸的多肽，最初从猪脑中分离提取，后来发现心脏亦能合成与分泌，而且浓度比脑内高。此外它也存在于肺、肾上腺等组织中。BNP有强大的利尿利钠、扩血管、降血压的作用。在脑组织，BNP主要在下丘脑合成，这部分脑组织受损时能大量释放BNP，以缓解颅内高压。过度分泌的BNP常常导致患者出现低血钠、高尿钠和低血容量，危及生命。

CSWS患者的基本治疗原则是：补充血容量和保持正钠平衡。然而补充钠盐只能缓解症状，并不能减少钠从肾脏的继续丢失，效果往往不佳。部分学者曾试用盐皮质激素-醋酸氟氢可的松来治疗低钠血症，虽然它能增加肾脏对钠的从吸收，改善患者症状，但这类药物可引起严重的低血钾和高血糖症状。因此，发展新的治疗途径来快速中合血液中的BNP对于CSWS的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明首次提出了一种能够快速中和血浆中脑钠肽成分的基因工程抗体(3C1)及其制备方法和应用。本发明的目的是通过基因工程技术制备抗血浆脑钠肽的基因工程抗体。该新型抗体是完全人源化的，可特异性中和血浆中脑钠肽，适用于脑性盐耗综合征相关性疾病的治疗。人源化是指，抗体基因全部由人类抗体基因所编码，可大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。

本发明提出了一种中和人脑钠肽的基因工程抗体3C1的制备方法，包括以下步骤：

a)将从噬菌体抗体文库淘筛获得的能特异性识别脑钠肽的噬菌体粒基因(3C1)用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒，构建成重组质粒pET22b-3C1；将pET22b-3C1(氨苄青霉素抗性)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS。

b)将基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37℃培养过夜，按1∶100比例转接后继续培养至OD_600nm≈0.4，加1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过Ni-NTA亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得高纯度、高活性的目的蛋白。

其中，所述步骤b)中2YT培养基的成分为胰蛋白胨1.6g，酵母提取物1g和氯化钠0.5g溶于1L蒸馏水中。

其中，所述步骤b)中将经离心获得含重组蛋白3C1的菌体先重悬于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，随后与100μg/ml溶菌酶混合，于30℃裂解30分钟，于4℃进行超声破菌，经12000r/min离心15min获得包涵体。

其中，所述步骤b)中洗涤步骤中采用的洗涤液成分为：含2mol/L尿素的50mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠及2％TritonX-100(v/v)，溶解步骤中采用的裂解液成分为：含8mol/L尿素的100mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠，5mmol/Lβ-巯基乙醇及5mmol/L咪唑。

其中，所述复性处理过程为：将10mg经Ni-NTA亲和柱纯化得到的变性基因工程抗体3C1逐滴加入到100ml复性液中，4℃过夜后，用透析缓冲液及PBS于4℃分别透析12小时，获得有活性的重组蛋白3C1；其中，所述复性液成分为：含2mol/L尿素的100mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.5mol/L L-精氨酸，所述透析液成分：含20nmol/L氯化钠的80mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.4mol/L尿素。

其中，所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS的脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。