[发明专利]高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在疫苗开发中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病毒固定株的选育方法及其应用，具体涉及一种高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在狂犬病疫苗开发中的应用。 

背景技术

狂犬病是一种严重的致死性流行病。感染狂犬病毒后一旦出现临床症状，存活的预后极差，死亡几乎不可避免。目前全球超过25亿人生活在狂犬病流行区而受到该疾病的威胁，每年导致5万多人死亡，其中半数以上是年龄小于15岁的儿童，他们是感染狂犬病的高危人群。中国也是狂犬病流行高发区，狂犬病死亡率长期居于中国各类法定传染病首位。 

由于没有任何针对狂犬病的有效治疗药物能够成功得到应用，研发狂犬病疫苗（包括人用疫苗和动物用疫苗）成为控制疾病危害的唯一有效手段。 

人用狂犬病疫苗的研发历史已超过百年。鉴于狂犬病的超高致死率，疫苗品种更新换代的需求比其他流行病疫苗更为迫切，研发更为安全有效的新一代人用狂犬病疫苗成为疫苗开发的热点。国内外研发了种类繁多的人用狂犬病疫苗新品种，包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等。在这些不同类型人用狂犬病疫苗研发品种中，全病毒灭活疫苗的保护效果是最好的，也是目前唯一得到临床应用的人用狂犬病疫苗。预计在未来相当长的一段时期，人用狂犬病疫苗的更新换代，依然将以全病毒灭活疫苗技术路线为重点。其中，Vero细胞疫苗以其安全性好、成本低以及适应于工业化生产等优势，成为国内外人用狂犬病疫苗研发的主流。 

现有的人用狂犬病疫苗存在免疫失败的问题，Vero细胞疫苗也不例外，尤其是针对严重暴露于狂犬病毒的人群，免疫失败比例较高。导致免疫失败的重要原因之一是疫苗生产用毒种免疫原性不够高。对于严重暴露于狂犬病毒的人群，如果疫苗生产用毒种免疫原性偏低，普通的抗原剂量就不足以保证疫苗的免疫保护效果，而进一步提高抗原剂量又可能导至免疫人群出现严重的不良免疫反应。通过提高疫苗生产用毒种的免疫原性，就有可能在不增加抗原剂量、保证安全性的前提下大幅度提高疫苗对所有免疫人群的保护效果。因此，高免疫原性疫苗生产用毒种的选育对人用狂犬病疫苗更新换代、进一步提高疫苗免疫保护效果、降低狂犬病的发病率和死亡率具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高免疫原性狂犬病毒固定株的选育方法，尤其是能用Vero细胞进行大规模、高产率培养的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育方法。 

本发明的另一目的是提供新的狂犬病毒固定株。具体涉及所述的狂犬病毒固定株，能以Vero细胞作培养基质高滴度培养；与国内外现有的狂犬病毒固定株相比，免疫原性更高；病毒基因组碱基序列及病毒蛋白质氨基酸序列与国内外现有的狂犬病毒固定株不同，且这些基因组碱基序列的差异和蛋白氨基酸序列的差异能稳定遗传，在以Vero细胞进行连续传代过程中至少15代以内保持不变。 

本发明还提供了以此选育方法得到的狂犬病毒固定株在开发人用或动物用疫苗中的应用。 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

（1）    鼠脑毒种的扩增和纯化

从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或其他经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种20-25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时无菌条件下取脑，加入维持液A（含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0）后研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3-5小时，收取蔗糖浓度为45%-55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0-10.0LogLD50/ml病毒悬液；

（2）鼠脑病毒对Vero细胞的适应培养