[发明专利]一种海洋信号芋螺毒素Lt14a荧光探针、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及到一种海洋信号芋螺毒素Lt14a荧光探针的制备方法及应用，是有关药物筛选的技术，属于生物技术领域。

技术背景

海洋药物的开发和研究是目前许多生物资源利用的重要组成部分，是海洋生物研究的热点。其中海洋软体动物芋螺含有丰富的毒液，其毒液中的芋螺多肽是非常具有生物学价值的一类天然物质。由于芋螺毒素能高度特异地识别和结合不同亚型的神经离子通道及受体，作为天然存在最为广泛的一类作用于神经系统的多肽分子，芋螺毒素成为神经药理学研究不可多得的来源。有些则被设计作为药物的导向化合物或直接开发为疗效特异的高效新药，因此，专家们将芋螺毒素称之为“药物宝库”，这对芋螺毒素的研究也有着重要的理论和实际意义。

长期以来对于毒素的生理作用最重要的方法是膜片钳技术，但是鉴于膜片钳技术的难度，设备要求和环境要求都有极其苛刻的要求，很难在普通的环境下得到研究数据。由于大规模的毒素筛选，采用膜片钳技术有一定的技术制约性，因此，我们探讨通过细胞膜染色定位的方法进行毒素作用位点的初筛，加快了毒素筛选的步骤，简化了方法。

芋螺毒素Lt14a，是从中国南海信号芋螺（Conus litteratus）的cDNA文库中得到的一种L‐超家族毒素，其半胱氨酸骨架为C‐C‐C‐C，理论上推测应该是配体门控乙酰胆碱受体的拮抗剂，与疼痛信号的产生传导有关。因此我们采用细胞膜定位的方法初步检测毒素作用的位点，为进一步膜片钳的筛选提供了有利的证据。

利用氨基反应对Lt14a进行荧光标记探针的制备，标记的Alexa Fluor488-Lt14a作用于PC12细胞表面呈现绿色荧光，乙酰胆碱受体拮抗剂Tubocurarine chloride（TUB）和阻断剂Hexamethonium bromide（HB）能够抑制Alexa Fluor488-Lt14a和细胞膜上乙酰胆碱受体的作用。

发明内容

本发明提供一种海洋信号芋螺毒素Lt14a荧光探针的制备方法及应用，采用本方法标记的海洋芋镙毒素Lt14a荧光探针可以用于细胞膜受体的检测，对毒素药理作用的筛选具有重要的应用价值。

附图说明

附图1Alexa Fluor488-Lt14a探针合成反相高效液相色谱图

附图2Alexa Fluor488-Lt14a探针MALDI-TOF-TOF质谱图

附图3A、B、C、D四个实验组的荧光显微镜镜检照片

具体实施方式

本发明中的海洋信号芋螺毒素Lt14a的氨基酸N端到C端序列：MCPPLCKPSCTNC。其C末端的氨基和Alexa Fluor488染料的羧基反应制备海洋芋螺毒素荧光标记探针Aleax Fluor488-Lt14a

实施例1：海洋芋螺毒素Lt14a的荧光标记探针的制备

1、实验试剂

488carboxylic acid,succinimidyl ester购买自invitrogen公司；乙睛（acetonitrile）购自天津四友化学公司；DMSO，三氟乙酸（TFA）购买自Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。

2、溶液配制

标记反应液：将488carboxylic acid,succinimidyl ester溶解于DMSO中，配成10mg/ml的母液，﹣20℃避光保存；

反应缓冲液：0.2M NaHCO₃，PH8.3；

Lt14a：15mg/ml溶液；

反应终止液：50μl DMSO+150μl0.1%TFA ddH₂O。

3、实验方法

（1）将Lt14a溶液与反应缓冲液（0.2M NaHCO₃）按1:1的比列混合，使NaHCO₃的终浓度为0.1M，制备成Lt14a的反应液；

（2）将（1）配好的200μl Lt14a反应液与400μl标记反应液按1:2体积比混匀，以此获得氨基反应体系；

（3）4℃避光，不停翻转反应36h；

（4）终止反应：加入反应终止液于反应体系中；

（5）利用HPLC纯化目的产物，即偶联的Alexa-Fluor488-Lt14a。HPLC洗脱条件：流动相A：水（含0.1%TFA），流动相B：乙腈(含0.1%TFA)，95%流动相A，5%流动相B线性梯度洗脱40min至5%的流动相A，95%流动相B，洗脱条件见表1。

表1反相高效液相色谱洗脱梯度