[发明专利]一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及快速检测微藻油脂含量的方法。

背景技术

生物柴油是新型“绿色能源”，具有可再生和环境保护的双重功效，符合国家“十二五”规划节能减排和低碳经济发展的战略需求。目前，生物柴油主要以动植物油脂（猪油、牛油、玉米、大豆、油菜籽等农作物）以及餐饮废油为主要生产原料，是替代传统石化能源、减少温室气体排放的新型可再生能源。然而传统的以农作物为原料生物柴油生产技术，对农作物需求量大，从而形成了“与人争粮，与粮争地”的局面，导致粮食价格上涨。因此，积极寻找新的生物质能源材料，缓解面临的粮食和能源危机、促进经济可持续发展已成为世界各国决策者和研究者高度关注的问题。

在生物柴油制备的各种原材料中，微藻是重要的可再生资源，同时也是生物柴油巨大的资源库，具有分布广泛、光合效率高、生长周期短、产量高、富含油脂、环境适应能力强，最重要的是不占用耕地等优点。同时，微藻的生长能够捕获废气中的二氧化碳，既可以降低生物柴油生产成本又可以缓解温室气体效应。因此，微藻生物柴油被认为是唯一可能取代化石油的重要替代品，发展前景广阔。

目前制约微藻生物柴油规模化的瓶颈问题是昂贵的生产成本，其根本也取决于微藻藻种的含油量。因此，培育出生长迅速、环境适应力强、富油的微藻新品种是微藻生物柴油提高产率和降低成本的关键。然而用传统的有机溶剂提取法测定微藻油脂含量繁琐、费力、成本高、易造成环境污染，同时其检测费时（通常为3～4天），难以满足富油微藻筛选大规模、快速、高效的要求。

尼罗红是一种疏水性较强的荧光染料，可以根据极性的不同展现出从黄色到红色的荧光颜色，但在水环境中尼罗红所发的荧光会完全淬灭。此外，由于尼罗红具有良好的光化学稳定性和特殊的发光波长范围，故可排除多数生物分子在测定中的干扰。经尼罗红染色后微藻细胞所发的荧光强度与胞内的油脂含量显著相关，并且尼罗红染色法耗时较短、所需生物样品量少、操作步骤较为简单，可直接用于测定微藻细胞的油脂含量，使分析测定方法明显简化。

由于微藻的细胞壁厚且坚硬，尼罗红不易穿透细胞与油脂粒结合，导致染色效果不理想，因此，采用有效的破壁方法以提高尼罗红的染色效果是实现快速、高效油脂检测方法的关键。

超声波振动时能发出并传递强大的能量，可以对媒质产生强烈的机械振动、空化、搅拌等作用。且其具有高效、能耗低、保持胞内物质生物活性等特点。通过超声波能高效的破坏细胞壁，使其中的成分溶于溶剂中，更有助于荧光染料的染色。然而，尚缺乏超声波应用于微藻荧光染色方面的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测微藻油脂含量的方法繁琐、费时、费力、成本高、易造成环境污染以及尼罗红对微藻细胞染色效果不理想的问题，而提供了一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法。

本发明的一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法，是由下列步骤实现的：

一、取微藻藻液，经离心收集固相物，加入等体积的去离子水或超纯水，得重悬微藻细胞，将其分成两份待用；

二、将步骤一得到的一份重悬微藻细胞，在温度为0～4℃的条件下超声破碎1～30min；

三、向步骤二超声破碎后的重悬微藻细胞中加入尼罗红混匀，避光染色1～30min，将染色后的微藻细胞分为两份；

四、取步骤三中的一份染色后的微藻细胞，采用三维荧光光谱对步骤三染色后的微藻细胞测定荧光强度；

五、取步骤三中另一份的染色后的微藻细胞，采用二维荧光光谱测定荧光强度，将染色后的微藻细胞二维荧光光谱所测定的荧光强度数值减去尼罗红和未进行尼罗红染色微藻细胞在二维荧光光谱相同波长下测得的荧光强度数值之和，即得相对荧光强度，然后取步骤一中的另一份重悬微藻细胞采用有机溶剂提取法测定油脂含量，构建相对荧光强度-油脂含量标准曲线；

六、根据标准曲线公式计算待测微藻的油脂含量；

标准曲线公式为：y=0.0268x-1.5532；其中，R²=0.9957，y为油脂含量，单位为mgL^-1；x为相对荧光强度；

其中，步骤三中所述的尼罗红加入量为加入尼罗红至溶液中尼罗红的浓度为0.1～5.0mgL^-1；步骤四中所述的三维荧光光谱激发波长为220～750nm，发射波长为220～750nm；步骤五中所述的二维荧光光谱的激发波长为450～550nm，发射波长为500～700nm。

本发明包含以下有益效果：