[发明专利]抗TNF-α人源骆驼化基因工程抗体TsdAb40及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是抗TNF-α人源骆驼化基因工程抗体TsdAb40及其制备方法与应用。

背景技术

由于抗体针对抗原具有高特异性和高亲和力的特性，使其在科学研究、疾病诊断和治疗中显示出无可比拟的优越性。抗体正越来越多的应用于科学研究，疾病预防、诊断和治疗等领域。基因工程抗体由于分子量小，易于构建和表达，是近年来抗体工程研究的热点之一，基因工程抗体已广泛应用于医疗和生物技术领域。但是，越来越多的应用显示，许多基因工程抗体的稳定性较差，在非极性液体、蛋白酶或高温环境中会发生降解和变性，从而不能发挥其应有的生物学作用，因此，在很大程度上限制了这些工程抗体的应用。目前，抗体稳定性工程已成为抗体工程研究中的一个特殊领域，探索有效的稳定性改构策略、构建经济、稳定的新型人源基因工程抗体，已经成为抗体工程研究中亟待解决的问题。

1993年，Hamers-Casterman等报道，骆驼的功能性抗体都由重链组成，天然缺失轻链，称之为重链抗体(heavy chain antibody，HcAb)。此HcAb仅由重链可变区(Vriable domain of heavy chain，VH)、一个铰链区（hinge region）和两个恒定区（constant region of heavy chain,CH）CH2和CH3组成。研究显示，这种结构简单的骆驼HcAb具有高度的构象稳定性，热稳定性好，在37℃孵育1周后仍具有80％的结合活性；而且能耐高温，具有可逆的去折叠能力，将其长期放在高于90℃的环境后仍能重新获得抗原结合能力，而McAb及其他的基因工程抗体片段常会在热变性后产生不可逆的聚合，丧失其部分或全部活性。骆驼HcAb抗体在蛋白酶、极度pH值等条件下显示出高度稳定性。抗体结构研究及基因序列分析结果表明，普通抗体的框架区（framework，FR）FR2中，V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基参与与VL的相互作用，属于疏水性氨基酸，而在HcAbs中，这几个氨基酸残基发生了改变，突变为F37、E44、R45和G47，由疏水性变为亲水性氨基酸，会使HcAb更易于溶解。利用这一特点，对人源抗体VH进行HcAb特征性改造，即将人VH FR2区44、45和47位点的疏水性氨基酸残基用HcAb中相对应亲水性氨基酸代替，研究表明，所得到的骆驼化单域VH抗体不仅保持原有抗体的特异性和亲和力，而且稳定性大大改进，并且具有很好的溶解性。对scFv等基因工程抗体的稳定性影响因素分析发现，以上疏水性氨基酸是导致抗体界面不稳定性的主要原因，这些疏水性氨基酸使抗体粘性增加，从而导致抗体易于聚集而失去活性。而骆驼HcAb界面的疏水性氨基酸残基由特别的亲水性氨基酸代替，有效的阻止了抗体的聚集，稳定了其空间构象，使其具有良好的热稳定性，并且可以抵抗温度、pH等变性因素的影响而正常发挥其有效的生物学作用。这为有效的抗体稳定性改构策略提供了新的思路，也为骆驼样人源基因工程抗体的研究奠定了理论依据。

肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是一种具有多种生物学活性的细胞因子，对多种疾病的发生、发展及转归具有重要影响。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞系产生，参与机体的免疫调节和细胞因子网络协调。正常情况下，TNF-α对免疫防御和免疫监督起着重要作用，但在某些情况下却有不良作用。研究显示，TNF-α过量表达可诱导促炎细胞因子如白介素1（interleukon-1，IL-1）、IL-6等的表达、增加内皮细胞通透性、上调粘附分子表达、激活中性白细胞和嗜酸细胞，并且诱导骨滑膜细胞和软骨细胞分泌急性期物质和组织降解酶等促进炎症的发生。这些病理反应在许多免疫介导的炎症性疾病（Immune-mediated inflammatory diseases，IMID）的发生发展中起着非常重要的作用，如风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、牛皮癣关节炎(psoriatic arthritis，PsA)、强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)、炎症性肠炎(inflammatory bowel disease，IBD)、幼年型慢性关节炎（juvenile chronic arthritis，JCA）以及脉管炎(vasculitis)等。研究表明，TNF-α是以上多种IMID的理想靶标，使用TNF-α拮抗药物（TNF-αinhibitors）来中和过量的TNF-α，是有效防治因TNF-α过度表达所致慢性炎症性疾病的理想途径。