[发明专利]影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物的生测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，属生物测定技术领域。 

背景技术

研究松材线虫的化学生态学，对了解松萎蔫病的致病机理及过程有着重要的意义。其中，生测手段必不可少。在快速检测昆虫触角对气味的反应方面，触角电位图(Electroantennogram，EAG)是非常重要的生物测定方法(赵新成等, 2004)。气相色谱与触角电位(GC-EAD)连用技术可以通过昆虫触角的化学感器对化合物进行识别，检测其中的活性组分。受限于目前的手段，线虫的信息素的研究手段无法像昆虫的一样，不能直接用仪器检测到线虫对活性组分的神经电脉冲信号。因此只有将待分析的VOCs经GC-MS分析和鉴定出所有的组分的结构，购买所有有可能的化合物或进行合成，再对线虫进行生测(Zhao等, 2007；Kaplan等, 2008；Niu等, 2010)。 

常用松材线虫的生测手段一般采用琼脂平板生测法，以水琼脂平板或木段等为基质，来研究松材线虫的移行。具体的方法如下：在培养皿中倒入2%琼脂水液，待琼脂凝固后，用记号笔在培养皿背面划线，以平板中心为原点，将平板均匀的等分为四个象限。 在第一或第三象限放入处理，一般为真菌小块或样品溶液等；在第二或第四象限放入对照，一般为培养基小块或溶剂等。然后在平板中心滴入线虫液，一段时间后检测线虫的移行情况。Mamiya(Mamiya, 2006)用水琼脂平板为生测材料，研究了木材腐生真菌的活菌丝对松材线虫的作用。赵莉蔺(Zhao等, 2007)以0.8%琼脂平板为基质，对马尾松和松褐天牛的挥发物对线虫的吸引作用进行了研究。龙瑞敏(龙瑞敏, 2007)分别以灭菌的淡水沙和水琼脂平板为基质，研究了松材线虫的移行。谈家金(谈家金等, 2009)在水琼脂平板和木段上研究了松树挥发物对松材线虫的吸引作用。 

上述琼脂平板生测法有两大不足，首先，它对生测样品的量需要量很大，以形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到；其次，采用了线虫在琼脂表面运动的方法进行，由于不同线虫的在自然界生境不同，存活的介质也不同，琼脂表面并不完全适合线虫的运动，特别是绝大多数线虫是在介质中运动，而不是在介质表面运动。因此这些方法影响线虫的运动，继而影响生测的灵敏度和准确性。 

Ishikawa (Ishikawa M, Shuto Y, Watanabe H. β-Myrcene, a Potent Attractant Component of Pine Wood for the Pine Wood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Pesticide Chemistry). Agricultural and biological chemistry, 1986, 50 (7):1863-1866.) 建立了一种生测方法，用于检测供试化合物 (5 mg) 的挥发物对松材线虫的吸引作用。他使用的生测装置是T型玻璃管，内含9 ml 1.5 %的琼脂。该装置的空腔体约为π × r² × h = 3.14 × (5 mm)² × 200 mm = 15700 mm³。且T型管顶部有个虹吸管，用于向外抽气。使用该方法，它对管内的样品的浓度要求很高，即需要的所测化合物的量很大 (毫克mg数量级)。使用该生测方法无法检测到GC分离得到的对松材线虫有生物活性的微量挥发物 (纳克ng数量级的化合物)。 

张田园((张田园, 牛秋红, 应树松, 刘艳, 王敏, 王珍珍, 过雨晴. 细菌Bacillus sp. NS-3和灰葡萄孢对松材线虫的诱引. 南阳师范学院学报, 2011 (06):47-50.)采用“水琼脂平板移行法”和“玻管法”，研究了松材线虫拮抗细菌Bacillus sp. NS-3和灰葡萄孢引诱线虫的能力。其方法为改良的玻管法，参考自Ishikawa的方法。采用玻管并在其上加装了虹吸管，对外抽气。方法中玻管内的空腔体积为π × r² × h = 3.14 × (45 mm)² × 7.5 mm = 47688.75 mm³，该方法同样对生测样品的量需要量很大，有着很高的要求。