[发明专利]一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物化学领域，尤其涉及胶原蛋白的提取方法。

背景技术

国内目前对利用复合酶提取活性胶原蛋白的研究刚刚起步，国内数所高校进行了复合酶提取活性胶原蛋白的研究，在蛋白酶的选择、酶解工艺等方面取得一定的进展。目前采用酶解法提取活性胶原蛋白，应用的蛋白水解酶较为单一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。对于大多数活性胶原蛋白的生物活性来说，其工业化生产还有一定的难度，主要是因为酶在胶原蛋白水解过程中容易变性，分离和提纯难度大，检测手段和技术不够成熟。

发明内容

发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：1）经过预处理的鱼皮混合液加入复合蛋白酶进行酶解；其中所述复合蛋白酶至少包含木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中两种；2）将得到的酶解液进行离心处理，取上清液；3）将上清液超滤浓缩后进行盐析；4）再次进行超滤脱盐并浓缩；其中，鱼皮混合液的浓度为2.0～8.0wt%，pH为2～6，所述复合蛋白酶的添加量为鱼皮混合液重量的2.0～8.0wt%。

作为优选，步骤1）的酶解温度为4～16℃，时间为6～10h，反应时体系的pH控制在5.0～9.0。

作为优选，步骤1）中还加入抑制剂。

作为优选，步骤2）中离心转速为4000～5000r/min。

作为优选，步骤3）超滤浓缩的操作压力为0.15-0.35MPa，温度4-10℃，pH 2-6，超滤膜孔径为10-50nm。

作为优选，步骤3）中盐析处理时，胶原蛋白溶液浓度为2.5-5.5%，NaCl浓度为10-30%，pH值为2-6，温度为4-10℃。

作为优选，步骤4）超滤浓缩的操作条件如下：操作压力0.5-1.0Mpa，温度为4-10℃，pH2-6，超滤膜孔径为100-200nm。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明利用单因素试验和正交试验对复合蛋白酶的水解条件进行优化，建立了pH、酶解温度、酶解时间、酶与底物的比例、底物浓度与酶水解度的关系，得到复合蛋白酶的最佳水解条件为：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例为1-3:1，复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液质量的2.0-8.0wt%，底物浓度2.0-8.0wt%，pH5.0-9.0，在4-16℃条件下酶解6-10h，其最高胶原蛋白提取率达到91.2%。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，将2.0～8.0%的鱼皮混合液中，调节pH到2～6进行预处理，然后加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的复合蛋白酶，加入量与鱼皮含量相同，并控制温度在10～12℃，酶解8h，在此过程中控制pH在5～9之间。然后将酶解后的上清液进行离心处理，转速在4500r/min左右。

将离心后的溶液进行第一次超滤浓缩，操作压力为0.15-0.35MPa，温度4-10℃，pH 2-6，超滤膜孔径为10-50nm；然后进行盐析：胶原蛋白溶液浓度为2.5-5.5%，NaCl浓度为10-30%，pH值为2-6，温度为4-10℃；最后进行第二次超滤：操作压力0.5-1.0Mpa，温度为4-10℃，pH2-6，超滤膜孔径为100-200nm。

本发明利用单因素试验和正交试验对复合蛋白酶的水解条件进行优化，建立了pH、酶解温度、酶解时间、酶与底物的比例、底物浓度与酶水解度的关系，得到复合蛋白酶的最佳水解条件为：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例为1-3:1，复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液质量的2.0-8.0wt%，底物浓度2.0-8.0wt%，pH5.0-9.0，在4-16℃条件下酶解6-10h，其最高胶原蛋白提取率达到91.2%。

在此基础上，本发明又系统优化和筛选了超滤浓缩、盐析、透析脱盐、超滤去除小分子等工艺条件，与前面的复合蛋白酶的水解条件相配套，建立了一套完整的复合蛋白酶提取活性胶原蛋白的方法。

本发明方法安全性高，无副作用，所制备得到的活性胶原蛋白具有提取率、纯度和热变性温度等优点。