[发明专利]小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，属于小鼠β-actin的cDNA的定量检测领域。

背景技术

β-actin即β肌动蛋白，是actin家族的一员，在维持细胞结构，细胞内运动，细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。β-actin基因是应用较为广泛的管家基因之一。管家基因(house-keeping genes)是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。在进行定量PCR时，可以通过计算目的基因和管家基因的比值，得到基因表达的相对浓度。

迄今为止，用于检测小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR试剂盒均不同程度的存在特异性差、灵敏度低、检测线性范围较窄等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够准确的定量小鼠β-actin的cDNA序列表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，该检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测线性范围广等优点。

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下各组分：荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和灭菌水二所述的特异性引物对由SEQ ID No．1和SEQ ID No．2所示的引物组成；所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID No．3所示。

其中，在探针的5’端标记有荧光报告基团，所述的荧光报告基团是FAM、HEX或ROX荧光报告基团，优选为FAM荧光报告基团；在探针的3’端标记有荧光淬灭基团；所述的荧光淬灭基团可以是TAMRA、BHQl或BHQ2等荧光淬灭基团，优选为TAMRA荧光淬灭基团。

其中，所述的荧光聚合酶链式反应液包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs；

为了达到绝对定量的结果，所述的试剂盒中还包含有小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品；本领域技术人员可以按照常规方法自行构建得到小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品，例如：在pUC57质粒的Sam I酶切位点插入SEQ ID No．4所示的基因片段，即得到小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品；也可通过商业途径购买得到小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品。

本发明试剂盒中各组分的用量可根据待检测样品的数量以及每次荧光定量PCR反应所需的用量来确定或进行相应的调整，这些都是本领域所属技术人员视检测情况或实际需要很容易就能确定的参数。

作为参考，采用本发明荧光定量PCR试剂盒检测小鼠β-actin的cDNA序列的PCR反应条件和PCR反应体系如下：

PCR反应体系：总体积25μl，上／下游引物260nmol／L，探针100nmol／L，5×PCR缓冲液5ul，dNTP200gmol／L，Mg²⁺3mmol／L，Ex TaqHS聚合酶1．5U，模板1．5μl，灭菌水16μl。

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s，60℃lmin，40个循环。

本发明试剂盒需采用各种市售的荧光定量PCR仪进行分析和检测，所述的荧光定量PCR仪可以是ABI系列荧光定量PCR仪、BIORAD iCycler、Roche4800、Qiagen Rotor Gene等。

本发明试剂盒对检测样本的要求：

检测样本来源：小鼠血液和组织脏器中基因组DNA.

样本制备：

(1)小鼠血液中DNA的提取，或组织脏器中DNA的提取可以按照市售DNA提取试剂盒说明书操作，也可以按照以下提供的方法操作：

(2)称取约25mg左右的组织脏器，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块。加10倍体积DNA提取缓冲液[50mM Tris C1(pH8.0)，0．1MEDTA(pH8．0)，0．1M NaCl]，用超声匀浆仪进行匀浆。取200μ1匀浆液于2ml的Eppendorf管中，缓慢加入20％SDS溶液，至终浓度1％，摇匀直至溶液变粘稠。再加入5μl蛋白酶K，55℃消化2-3h或过夜。并间歇搅动。或取200μl EDTA抗凝的全血，加入5μ1蛋白酶K，55℃消化2-3h或过夜。

(3)取出匀浆液，放置室温，加入50μl5M的NaCl至终浓度为1M。再加等体积饱和酚抽提，以12,000rpm离心5min。