[发明专利]一种基于单一标准品的四色荧光定量PCR方法和试剂盒

权利要求书

1.本发明的基于单一标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，其特征在于采用单一的标准品作为实验的阳性对照和定量标准通过一步法PCR扩增检测各类处理后标本中A组轮状病毒（HRVA）、诺如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、诺如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星状病毒（HAstV）RNA，用于引起腹泻症候群的常见的A轮状病毒、诺如病毒Ⅰ群、诺如病毒Ⅱ群和人星状病毒的实验室快速高通量检测和疫情监控。

2.根据权利要求1所述的一种检测方法，本发明的检测方法实验步骤包括：1）感染或疑似样本采集和运送；2）样本预处理和提取RNA；3）一步法四重四色荧光定量PCR样本进行检测；4）根据单一标准品的扩增曲线标本中的病毒进行精确定量。

3.根据权利要求1所述的检测方法和试剂盒，用于检测A组轮状病毒（HRVA）、诺如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、诺如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星状病毒（HAstV）特异性的引物和荧光探针为：A组轮状病毒上游引物HRVA-F1（SEQ ID NO.1）、下游引物HRVA-R1（SEQ ID NO.2）和荧光探针HRVA-P（SEQ ID NO.3）；诺如病毒Ⅰ群上游引物NVGⅠ-F1（SEQ ID NO.4）、下游引物NVGⅠ-R1（SEQ ID NO.5）和荧光探针NVGⅠ-P（SEQ ID NO.6）；诺如病毒Ⅱ群上游引物NVGⅡ-F1（SEQ ID NO.7）、下游引物NVGⅡ-R1（SEQ ID NO.8）和荧光探针NVGⅡ-P（SEQ ID NO.9）；人星状病毒上游引物HAstV-F1（SEQ ID NO.10）、下游引物HAstV-R1（SEQ ID NO.11）和荧光探针HAstV-P（SEQ ID NO.12）。

4.根据权利要求3所述的特异性引物和探针，四种病毒RNA的四重四色荧光定量PCR特异性扩增检测的靶区域分别是：A组轮状病毒（SEQ ID NO.13）、诺如病毒Ⅰ群（SEQ ID NO.14）、诺如病毒Ⅱ群（SEQ ID NO.15）和人星状病毒（SEQ ID NO.16）。

5.根据权利要求1所述的一种试剂盒，针对A组轮状病毒（HRVA）、诺如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、诺如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星状病毒（HAstV）四种病毒的靶序列进行分析并在各序列之间引入无义序列，设计4段不同的标准品序列，每个片段在100-120bp之间，接头处有不少于6-8个序列重复，以病毒靶片段为模版进行第二次扩增，在体外将所有对应的扩增片段混合作为模板经第三次PCR扩增即可拼接得到单一的长片段基因，作为单一标准品的核酸序列，克隆入pMD18-T载体，制备成标准品。

6.根据权利要求1所述的一种单一标准品的四重四色荧光定量PCR检测试剂盒，制备该种制备成标准品的用到的引物为A组轮状病毒上游引物HRVA-F2（SEQ ID NO.17）和下游引物HRVA-R2（SEQ ID NO.18），扩增片段为（SEQ ID NO.19）；诺如病毒Ⅰ群上游引物NVGⅠ-F2（SEQ ID NO.20）和下游引物NVGⅠ-R2（SEQ ID NO.21），扩增片段序列为（SEQ ID NO.22）；诺如病毒Ⅱ群上游引物NVGⅡ-F2（SEQ ID NO.23）、下游引物NVGⅡ-R2（SEQ ID NO.24），扩增片段序列为（SEQ ID NO.25）；针对人星状病毒上游引物HAstV-F2（SEQ ID NO.26）和下游引物HAstV-R2（SEQ ID NO.27），扩增片段序列为（SEQ ID NO.28），最终经过第三次扩增HRVA-NVGⅠ-NVGⅡ-HAstV单一标准品的模板片段序列为（SEQ ID NO.29）。

7.根据权利要求1其中所述的试剂盒，反应体系（PCR MIX）的按照如下方式配制：每份反应液(PCR MIX)体积为20.0ul，然后加入逆转录酶系1.0ul、Taq酶系1.0ul、RNA/标准品/阴性对照3.0ul，无需经过单独进行逆转录反映直接一步法进行扩增。

8.根据权利要求1所述的四重荧光定量PCR试剂盒，每个反应槽同时选择FAM、HEX、ROX和CY5荧光通道，分别对应A组轮状病毒（HRVA）、诺如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、诺如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星状病毒（HAstV）RNA的检测。

9.根据权利要求1所述的四重荧光定量PCR试剂盒，使用Stratagene公司的Mx3000P和Mx3005P、ABI PRISM7300/7500、ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、MJ Opticon等使用荧光定量PCR仪，扩增条件为 42℃→20分钟，然后93℃→2分钟，然后93℃ 30秒→55℃ 45秒（在此步骤采集荧光信号），40个循环。