[发明专利]Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因位点甲基化检测方法。

背景技术

SLE是一种由于自身免疫反应引起的慢性炎性疾病，以多个器官、组织受累和血清中有多种自身抗体为特征，但其发病机制尚未明了，大量资料证明是在遗传、环境、感染和性激素等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。SLE患者临床异质性大，病情迁延，反复波动。因此，在诊断SLE 时，应进行包括其活动性与严重程度的病情判断，以利于选择治疗方案。但是对于SLE活动度的判定并非易事，活动性与重症度并非是平行关系，且SLE是多脏器受害的疾病，受侵犯脏器损害不同，对疾病活动性的评价也会发生变化。包括对感染性疾病在内的其他疾病进行鉴别，进一步加大了活动性判定的难度。

现行的SLE活动性判定依据主要有：SLE病情活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)、狼疮活动测量标准(systemic lupus activity measure，SLAM)、欧洲统一狼疮损伤指数(European consensus lupus damage index，ECLAM)和大不列颠群岛狼疮评估组指数(British Isles lupus assessment group，BILAG)，其中SLEDAI和BILAG是目前狼疮随机临床试验最常用的两个评估工具。但上述各种评分方法仍不完美,各有优缺点。单独使用，有时并不能对活动性给出准确的评判。因此，需要一种更为有效、更为精准判定方法。

CD4+ CD25+ 调节性T细胞（Treg）首次由日本学者Sakaguchi等于1995年所报道，这类T细胞介导的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键，此发现引起了免疫学界的广泛关注。Treg的免疫抑制性是指经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+ CD25- T细胞的活化和增殖。大量研究表明，Treg不仅在自身耐受的获得和维持及自身免疫的防御中起重要作用，在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中也扮演重要角色。虽然其机制至今还不是十分明确，但大量研究表明Treg细胞的发育、功能的发挥与一个蛋白质分子——Foxp3有着密切的联系。Foxp3是一种转录因子，它能通过调控特定基因的表达，从而控制Treg细胞的分化成熟。

有研究发现与非活动性SLE患者和健康对照组相比，活动性SLE患者外周血CD4+ T细胞表面CD69 表达增多，而CD25 的表达明显减少，这一现象提示，活动性SLE患者中T 细胞被大量激活，却没有诱导出免疫调节性Treg细胞。进一步研究显示SLE患者外周血Foxp3的表达也明显低于对照组，它的表达水平与CD4+ CD25+ 调节性T细胞数量存在依赖关系。Treg细胞在发挥抑制作用机制中起着重要作用。因此，活动性SLE患者体内缺乏CD4+CD25+ T细胞可能会导致机体抑制自身免疫反应的功能减弱，并与SLE 的发生发展密切相关。

目前，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-High Resolution Melting Curve Analyse，简称MS-HRM）是一种不需要 PCR 产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法在甲基化修饰位点附近设计实时定量PCR引物，对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行特异性PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不变，随后使用含饱和DNA结合染料的PCR体系扩增，扩增后通过比较曲线的熔解温度和峰形进行分析。MS-HRM因其高敏感性，可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源的初始模板的甲基化修饰差异。但MS-HRM的数据一直没有一种公认的分析方法，目前结果分析大多采用标准曲线法，将甲基化和非甲基化对照DNA（经过重亚硫酸盐修饰）以不同比例混合，创建一系列甲基化梯度标准品。结合标准品的特征熔解曲线和温度，用专门软件进行计算分析，从而得出样本中的DNA甲基化比率。这种方法使得实验更加繁琐，增加了实验环节，在标准品在配置的过程中极易因操作原因，导致标准品配比不准确，使得实验准确性和重复性大打折扣。且加大了实验成本，延长了实验时间。因此限制了MS-HRM技术在临床诊断的推广应用。 

发明内容

，本发明的目的在于基于并改进现有MS-HRM方法，提供一种更为简单的检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。