[发明专利]叶片中叶绿素无损测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及叶绿素的检测分析方法，具体涉及一种叶片中叶绿素无损测定方法。

背景技术

叶绿素含量是衡量植物光合作用与生长状况的一项重要指标，叶绿素含量检测技术的研究在农业生产、林业研究等方面有着至关重要的意义。传统的叶绿素含量检测方法都是先提取叶绿素，再用分光光度法测定其含量。这种方法具有耗时长、对叶片有破坏性、不便于野外测量、不便于连续测量等诸多缺点。而现在使用比较多的是叶绿素测定仪来进行测量，使用这种方法虽然弥补了传统测量方法的缺点，能够快速无损伤估测准确的测量叶绿素含量，但也存在许多不足之处。

迄今为止国内外叶片叶绿素无损测定普遍采用透射式比色方法，例如日本柯尼卡美能达公司的SPAD 502plus叶绿素仪、美国国OPTI电器公司CCM--200型手持叶绿素计、英国Hansatech公司CL-01叶绿素仪、美国FT绿色有限公司产品atLEAF叶绿素仪等，以及我国一些厂家所生产的SPAD的叶绿素仪，均采用透射比色方法，其测值是一个与叶绿素含量相关的相对指标。这些现有方法的优点是无损测定、方便、快捷、效率高，其不足之处主要是：

①测定的叶片厚度受限，含量浓度受限：这是由于叶片是一个透明度很低的检测对象；据SPAD说明书称其最大可测定厚度为1.2mm，实际上当叶绿素浓度较大时其分辨率就已经很低了；

②测试得到的相对指标与叶片叶绿素含量之间的关系，需要按照作物品种、生长期、取样部位建立不同的相关曲线才能取得；

③不能反映叶绿素a、叶绿素b，组成成分的数量和比例；

④不能定量，只是半定量性的估测。

目前反射式检测技术已有广泛性应用，如德国默克尔公司的RQ-reflex反射式植株营养诊断仪，通过试纸条的反射光比色，测定叶片硝酸盐含量。但它属于有损检测，需要采下叶片，处理成显色溶液才能比色测试。尚未见有关反射式比色无损测定植株叶片成分的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速简便的叶片中叶绿素无损测定方法，该测定方法不受叶片厚度限制、适用于任何作物、任何品种、任何生长期、任何采样部位，且检测成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种叶片中叶绿素无损测定方法(2个波长法)，包括以下步骤：

①选定检测光波长：以叶绿素a吸收光谱曲线和叶绿素b吸收光谱曲线相交汇区的波长为工作波长，以叶绿素a和叶绿素b都没有吸收的近红外光谱区为参照波长；

②求叶绿素反射率：分别以工作波长、参照波长的单色光依次照射在待测叶片和参照反射板(照射在参照反射板上，目的在于调校检测仪器)上，使其产生漫反射，以光电反射仪检测记录两种波长下的漫反射率R_工、R_参1，以下式求得叶绿素反射率：

R＝R_工-r₁×R_参1，

上式中R为待测叶片中叶绿素反射率；R_参1为参照波长照射下的待测叶片基质的漫反射率；R_工为工作波长照射下的叶片的漫反射率；r₁为系数，取值0.9～1.8；

以参照波长测定待测叶片的基质反射率(在参照波长下，叶片基质对光有吸收而叶绿素对光无吸收，因而叶片的反射率就是叶片基质的反射率)，乘以一定系数r₁，在计算叶绿素反射率时予以扣减(消除叶片基质本身的干扰)，r₁的取值范围0.9～1.8，可进一步通过实验室验证进行优化选择。

③计算叶绿素反射函数：将上步所得叶绿素反射率R代入下述库比尔卡-芒克公式计算出待测叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM：

F_KM＝(１－R)²/2R；

④计算叶绿素总含量：由下式将所述反射函数换算为待测叶片中的叶绿素总含量：

C＝B×F_KM，

上式中C为待测叶片中叶绿素总含量；B为标定的换算系数，其标定方法为测定任一个已知叶绿素含量的叶片的反射函数，求得叶绿素含量与反射函数的比值。

也可以下述步骤取代上述步骤④：

先以所述步骤①～③得到一定数量的同类植物叶片中所含叶绿素的反射函数F_KM，并按常规方法测定其叶绿素含量，然后将按常规方法测定的叶绿素含量与对应的叶片反射函数F_KM进行回归：