[发明专利]一种建立菊花脑高效再生体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于菊花生物技术育种领域，涉及一种建立菊花脑高效再生体系的方法。

背景技术

菊花脑（Chrysanthemum nankingense）又名菊花菜、菊花叶，为菊科菊属多年生宿根草本植物，为栽培菊花近缘种植物，原产于中国，上海、江苏、吉林、湖南、广东等省有野生种，我国南北各地均有少量栽培。菊花脑是一种很有特色的传统野生蔬菜，其嫩茎和叶不仅营养丰富，还具有消暑清热、调中健脾、降压开胃等保健功效，现已成为南京地区的特色菜之一。

菊花是中国十大名花和世界四大切花之一，由于其起源复杂，染色体组成多样，对其重要观赏性状形成机理进行研究解析是极为困难的。菊花脑为栽培菊花起源中参与起源且遗传背景比较简单的菊属野生植物，本课题组希望利用遗传背景相对简单的二倍体菊花脑开展基础生物学研究，来更好的解析菊花中复杂的生物学现象，并以此展开品种改良研究，推动菊花新品种的选育。

目前关于菊花脑的组织培养已有报道，但外植体材料多采用叶盘、叶柄和茎等器官，以菊花脑花蕾为外植体进行组织培养和快速繁殖至今未见报道。而且以叶、茎等器官为外植体进行组织培养时，存在愈伤组织易褐化，不定芽分化困难等问题，因此，系统深入研究其再生能力及获得再生植株，建立专门针对菊花脑的稳定高效的再生体系，可为菊花的进化研究、基因工程和转基因育种工作提供理论基础和试验依据，将有效推进高等植物生物技术育种进程。

发明内容

技术问题

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种建立菊花脑高效再生体系的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种建立菊花脑高效再生体系的方法，包括如下步骤：

A.花蕾的选择及消毒：选择菊花脑幼嫩花蕾，对花蕾进行消毒；

B.再生体系的建立

取上述消毒后的菊花脑花蕾，接种于分化培养基进行不定芽的分化，待不定芽长至1～2cm时，转入1/2MS生根培养基中进行生根培养，获得完整植株；其中所述的分化培养基为含有细胞分裂素6-BA或激动素KT和类生长素NAA（a-萘乙酸，下同）的MS培养基，MS培养基中含蔗糖30g·L^-1、琼脂7g·L^-1，pH为5.8，6-BA终浓度为1.0或2.0mg·L^-1，KT终浓度为1.0或2.0mg·L^-1，NAA终浓度为NAA0.25或0.50mg·L^-1；其中培养条件均为：培养室温度：25±2℃；湿度：50%～70%；光照周期：16h·d^-1；光照强度：32～36μmol·m^-2s^-1。

步骤A中选择的花蕾优选直径为3mm，不带花柄的菊花脑幼嫩花蕾。

步骤A中所述的消毒优选于秋末采取菊花脑幼嫩花蕾，经清水冲洗，在无菌条件下先用75%乙醇浸泡，再用0.1%升汞消毒，最后用无菌水冲洗5次，无菌水的冲洗时间依次为3min,4min,5min,4min,3min。

所述的进行不定芽的分化培养时间至少30天。

所述的分化培养基优选MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1，即以MS为基础培养基，添加细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1、NAA0.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1及琼脂7g·L^-1。

有益效果

（1）本发明首次针对菊花脑花蕾的再生能力进行了系统深入的研究，不仅为菊花脑的基因工程和转基因育种提供了基本方法，也为菊花脑的规模化生产提供了参考。

（2）在再生体系建立中，将花蕾按大小、是否带花柄进行分类，观察不同类型花蕾的愈伤生长和再生情况，筛选出最适合培养的花蕾类型（不带花柄，直径为3mm的幼嫩花蕾）；将三种激素（细胞分裂素6-BA和KT、类生长素NAA）搭配组合，筛选出最适诱导分化培养基（MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L^-1+类生长素NAA0.5mg·L^-1），此处理的出芽率达79.63%，平均芽数达4.72，再生苗为绿色，生长状态良好；不定芽生根培养基以不加激素的1/2MS生根培养基生根效果最优，且生根率为100%。

附图说明