[发明专利]一种人胎盘成肌纤维母细胞的简易分离及鉴定方法

说明书

发明领域

本发明涉及从人胎盘蜕膜面分离成肌纤维母细胞并对成肌纤维母细胞进行鉴定的方法。

背景技术

胎盘被认为是最具有吸引力的“成体干细胞”，能在适宜的体内或体外环境下分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。由于胎盘干细胞材料来源相对方便，易于分离和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且不存在免疫排斥的特性；因此近年来已成为干细胞研究中的热点，在免疫疾病治疗、造血干细胞移植、组织工程、基因工程等领域具有较好的应用前景。

成肌纤维母细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞, 来源于中胚层干细胞, 在胚胎发育过程中先由间充质细胞分化而来, 然后分裂、融合成多核肌纤维, 形成肌小管, 再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。

Oliver C从胎盘蜕膜中分离得到一种细胞，该细胞能表达平滑肌肌动蛋白并且有类似于成肌纤维细胞的亚显微结构；Zuzana Strakova从胎盘中分离的成肌纤维细胞，在特定培养基诱导下，能够分化为脂肪细胞、成骨细胞，证明了胎盘成肌纤维细胞的多潜能性，为其在再生医学领域的研究提供理论支持；Ludovic Micallef研究发现成肌纤维细胞在受伤组织伤痕修复及功能恢复方面起着重要的作用；而Ori Eyal在体外把胎盘肌纤维细胞于雌激素等诱导因子共同培养，证明了催乳素可通过自我分泌的机理阻止子宫细胞的蜕膜化。成肌纤维细胞独有的特点和多潜能性，及其材料来源丰富，为细胞模型建立及再生医学的研究提供了良好材料。

然而，目前国内针对胎盘成纤维母细胞的分离鲜有报道，即使有报道，也主要集中在MSC或干细胞的分离方面，如CN 102586184 A（中国专利申请号201210044638.6，公开日期2012年7月18日）公开题为“建立胎盘间充质干细胞库的方法”的发明；CN 101395266 A（中国专利申请号200680053575.3，公开日期2009年3月25日）。

在国际上关于胎盘纤维母细胞的报道中，分离方法都集中于酶消化法，但在消化过程中有很多酶的参与：如美国伊利诺伊大学Zuzana Strakova在分离胎盘成纤维细胞时，使用胶原酶、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶、链霉蛋白酶四种酶混合反应消化获得成纤维细胞，多种酶的参与势必会造成实验步骤上的复杂和资源的不必要浪费。

成肌纤维母细胞由间充质干细胞分化而来，那么其应该保持着间充质干细胞的一些特性，包含贴壁生长特性，特定细胞表面抗原标志物的表达，向成脂，成骨方向的分化的能力等。

成肌纤维母细胞是成体干细胞的一种，能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞，其可能表达一种或者多种多能干细胞因子。

结蛋白（Desmin）是一种中间丝蛋白，广泛存在于大血管的平滑肌细胞，通过鉴定结蛋白的表达，可以验证细胞的肌原特性。且有文献报道随着成肌纤维母细胞的纯化，结蛋白的表达也逐步增强。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单实用的从胎盘蜕膜层大量分离成肌纤维母细胞的方法和鉴定分离的成肌纤维母细胞的方法。

本发明的胎盘成纤维母细胞分离方法是，利用手术刀及镊子剔除蜕膜面的输血组织等组织，仅留取靠近胎儿的蜕面，只是用胶原酶消化组织，其具体步骤包括：

1、取新鲜胎盘组织，用手术刀在胎盘中央处取约5 cm长宽的组织；用生理盐水清洗去除组织中血液；

2、用镊子手术刀剥除羊膜和底蜕膜上的血管组织，留取胎儿面蜕膜组织；

3、胎盘婴儿面蜕膜组织用75%酒精快速洗涤10秒；

4、75%酒精消毒洗涤后以生理盐水洗涤两次；

5、用手术刀把胎儿面蜕膜组织切割成0.5 cm左右碎片；

6、以与组织碎片等体积的含1%胶原酶I的DMEM消化液37 ℃消化16-18 h，消化溶液中无胎盘组织片后停止消化；

7、离心收集单个核细胞，用10% 胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞；

8、在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下培养箱中培养48 h，诱导贴壁；

9、细胞形成单克隆后，挑取单克隆细胞培养，待细胞融合度达到90%时，0.25%胰酶消化，即得胎盘成肌纤维母细胞。

本发明还通过流式检测细胞表面抗原和细胞周期、细胞多项分化潜能实验鉴定分离纯化后所得细胞的间质细胞特性，通过多能性干细胞因子的检测鉴定细胞的干性，通过细胞形态学观察及细胞结蛋白的表达鉴定细胞的肌原性。