[发明专利]一种试剂盒及操作方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫测定技术领域，尤其涉及一种试剂盒及操作方法。

背景技术

目前我国对奶牛妊娠检测仍然主要依靠直肠检查，并造成了一定的人为性妊娠流产。孕酮是一种甾体类激素，常作为反应卵巢活动的指示剂，在奶牛生产中，通过监测机体孕酮含量变化来检测奶牛的妊娠、卵巢机能和繁殖状况，是预防和治疗母畜繁殖障碍性疾病的一种有效方法。而奶牛乳汁孕酮检测，可以避免对奶牛本身的应激，减少人为对奶牛繁殖的影响，是奶牛机体孕酮含量测定的有效途径。

国内对奶牛乳汁孕酮检测的研究相对国外还有一定的差距，目前已有相关试剂盒面世，在临床应用中取得了不错的效果。针对奶牛乳汁孕酮的检测，本实验室应用自己制备的酶标孕酮抗原和孕酮单克隆抗体，建立了孕酮直接竞争ELISA快速检测方法，应用于试剂盒的初步研制。

试剂盒的质量控制是一个严重的问题，酶联免疫吸附试验(ELISA)在具体操作时主要存在技术误差、操作误差和统计误差。因此，需要建立一个统一的标准，以便得到高质量的结果，有助于应用与诊断。

发明内容

本发明实施例提供一种试剂盒及操作方法，旨在解决上述问题。

本发明实施例是这样实现的，一种试剂盒，所述试剂盒的组成包括：96孔酶标板一块，孕酮标准品1mL及去激素乳8mL，酶标记物5mL，底物A液150μL和底物B液10mL，终止液5mL及洗涤液20mL。

本发明实施例还提供一种试剂盒操作方法，所述方法包括下述步骤：

利用蒸馏水配制洗涤工作液；

取出酶标板，利用所述洗涤液洗涤3min/次，洗2次；

将去激素乳将孕酮标准品配制成不同梯度的孕酮浓度，各浓度孕酮标准浓度及待检样本分别等比例与酶标记物混匀后，以100μL/孔加入酶标板各孔，在37℃湿盒反应50min；

取出酶标板，倒掉孔内液体，洗涤酶标板3min/次，洗3次；

利用底物B液将底物A稀释液成工作液，以100μL/孔加入酶标板，避光反应15min；

在酶标板中加入终止液50μL/孔，终止反应；

利用酶标仪测定OD450nm值。

本发明实施例通过对ELISA试剂盒相关试剂稳定性的筛选，确定了不同的稳定剂及相关的处理方法，从而保证了试剂盒的保存时间。

附图说明

图1是本发明实施例提供的酶标板稳定性示意图；

图2是本发明实施例提供的酶标抗原稳定性示意图；

图3是本发明实施例提供的工作液A稳定性示意图；

图4是本发明实施例提供的工作液B稳定性示意图；

图5是本发明实施例提供的试剂盒抑制曲线示意图；

图6是本发明实施例提供的试剂盒测定曲线示意图；

图7是本发明实施例提供的试剂盒在37℃保存9天结合率示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例通过对ELISA试剂盒相关试剂稳定性的筛选，确定了不同的稳定剂及相关的处理方法，从而保证了试剂盒的保存时间。

在本发明实施例中，试剂盒的组成包括：96孔酶标板一块，孕酮标准品(40ng/mL)1mL及去激素乳8mL，酶标记物5mL，底物A液(100倍浓缩液)150μL和底物B液10mL，终止液(2MH₂SO₄)5mL及洗涤液(10倍浓缩液)20mL。

在本发明实施例中，为试剂盒整体效果做基础，需要考虑各个部分的稳定性，各部分稳定性筛选如下：

1.酶标板稳定性筛选

在本发明实施例中，孕酮单克隆抗体在最佳包被、封闭方式处理后，倒掉孔内液体；置于温度30℃、湿度低于30％的条件下处理酶标板120min，同时设置空白对照。取出酶标板用放入干燥、密封的袋中后，分别置于37℃进行加速破坏和4℃对照，每天分别拿出一块，按ELISA法检测酶标板上固相抗体的活性。

2.酶标记物稳定性的筛选

在本发明实施例中，通过添加不同的稳定剂，保证酶标记物的酶活性及抗原、抗体的免疫学活性达到稳定的效果。

用配制好的稳定剂溶液稀释酶标抗原到工作浓度，同时设置空白。配制后的工作液分别置于37℃进行加速破坏和4℃对照，并作新鲜对照。每天按直接ELISA法检测酶标抗体工作液的活性。