[发明专利]一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物叶片全蛋白提取方法领域，特别涉及了一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法。

背景技术

蛋白质组学(Proteomics)作为功能基因组学研究的重要支柱，已成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域。近年来，随着果树基因组研究工作的不断深入和完善，蛋白质组学分析技术已有应用于苹果、梨、葡萄、桃、香蕉等主栽果树品种上的研究报导，为果树蛋白质组学研究的开展提供了理论依据和技术参考。

双向电泳技术作为蛋白质组研究的核心技术之一，目前已广泛应用于生物学研究的各个领域。双向电泳研究过程中涉及的影响因素很多，研究证实，蛋白质样品的提取和纯化是双向电泳研究的前提，也是蛋白质组学研究的关键。

关于苹果叶片蛋白质提取方法的研究报道中，双向电泳图谱的质量仍然不是很好，有必要对苹果叶片总蛋白提取技术做进一步研究。因苹果叶片富含酚类、色素、多糖等多种次生代谢物质，严重影响了蛋白质样品的纯度，使其制备工作较为困难。

发明内容

本发明的目的是以田间苹果幼嫩叶片为试材，实现苹果属植物叶片材料总蛋白的提取，为苹果叶片相关的蛋白质组学研究提供依据，特提供了一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法。

本发明提供了一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的苹果属植物叶片全蛋白提取方法，具体为：

采摘叶龄为20～25天的幼嫩叶片，无菌水清洗后快速风干，用锋利刀片去除叶片叶柄部分，准确称取2克，用液氮在研钵中迅速研磨成精细粉末，粒径约为40-60微米，研磨时间3分钟；

加入4ml的匀浆缓冲液，4℃下涡旋振荡10分钟；

匀浆液中加入等体积的Tris-饱和酚，具体为三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制的pH 8.0的苯酚溶液，4℃下，涡旋摇荡20分钟；

将匀浆液转入离心管中，4℃下15000×g，离心30分钟，上层酚相转移新离心管；

重新加入同体积的上述匀浆缓冲液,4℃下涡旋震荡10分钟，15000×g离心10分钟；

继续回收酚相，加入5倍体积0.1M甲醇醋酸铵溶液，-20℃条件下沉淀4小时以上；

溶液在4℃下，15 000×g，离心10分钟，沉淀物经冷丙酮（含20mM二硫苏糖醇）漂洗三次，室温风干，得到蛋白干粉，-80℃条件下保存备用。

所述的匀浆缓冲液中含有20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（pH 7.5）、250mM蔗糖、10mM乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸、1mM苯甲基磺酰氟、1mM二硫苏糖醇、1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100、10%聚乙烯聚吡咯烷酮。

本发明的优点：

本发明所述的苹果属植物叶片全蛋白提取方法，以田间苹果幼嫩叶片为研究试材，苹果属植物叶片材料总蛋白提取纯度高，方法简单，为研究苹果叶片相关的蛋白质组学研究提供了依据。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的苹果属植物叶片全蛋白提取方法，具体为：

采摘叶龄为20天的幼嫩叶片，无菌水清洗后快速风干，用锋利刀片去除叶片叶柄部分，准确称取2克，用液氮在研钵中迅速研磨成精细粉末，粒径约为40微米，研磨时间3分钟；

加入4ml的匀浆缓冲液，4℃下涡旋振荡10分钟；

匀浆液中加入等体积的Tris-饱和酚，具体为三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制的pH 8.0的苯酚溶液，4℃下，涡旋摇荡20分钟；

将匀浆液转入离心管中，4℃下15000×g，离心30分钟，上层酚相转移新离心管；

重新加入同体积的上述匀浆缓冲液,4℃下涡旋震荡10分钟，15000×g离心10分钟；

继续回收酚相，加入5倍体积0.1M甲醇醋酸铵溶液，-20℃条件下沉淀4小时以上；

溶液在4℃下，15 000×g，离心10分钟，沉淀物经冷丙酮（含20mM二硫苏糖醇）漂洗三次，室温风干，得到蛋白干粉，-80℃条件下保存备用。

所述的匀浆缓冲液中含有20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（pH 7.5）、250mM蔗糖、10mM乙二醇-双(2-氨基乙醚)四乙酸、1mM苯甲基磺酰氟、1mM二硫苏糖醇、1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100、10%聚乙烯聚吡咯烷酮。

实施例2

本实施例提供了一种苹果属植物叶片全蛋白提取方法，其特征在于：所述的苹果属植物叶片全蛋白提取方法，具体为：