[发明专利]检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。

背景技术

一、核苷和核苷类似物类药物作用机制：

人类免疫缺陷病毒（HIV）属于逆转录病毒，又分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染，现有药物主要是抑制HIV-1型病毒的复制。自从1995年开始应用新的抗病毒治疗方案，即联合使用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的HAART以来，HIV感染的临床进程被大大改变。这些药物通过阻断病毒复制使得免疫系统重建其CD₄⁺T细胞库并恢复对病原体的免疫力，明显降低了HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。截至目前，美国FDA已经批准了4大类共26种抗病毒药物用于艾滋病的临床治疗，其中包括核苷类逆转录酶抑制剂（nucleoside reverse transcriptase inhibitor，nRTI）、非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）、蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitor，PI）和融合抑制剂（fusion inhibitors）。我国已有5种国产抗病毒药物进入临床。

在HIV-1的复制循环中，逆转录酶在完成RNA指导的DNA合成、RNA水解反应和DNA指导的DNA合成过程中起着十分重要的作用。因此，HIV-1逆转录酶是抗HIV/AIDS药物设计的一个重要生物靶点。目前市场上出现的以HIV-1逆转录酶为靶点的药物按作用机制和化学结构可分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。

核苷类逆转录酶抑制剂是最先问世、开发品种较多的一类药物，临床证实对HIV复制具有很强的抑制作用，核苷类逆转录酶抑制剂（nRTIs），是HIV病毒逆转录酶作用底物脱氧核苷酸的类似物，在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性与HIV逆转录酶（reverse transcriptase，RT）结合，抑制RT的作用，阻碍前病毒的合成。已上市的nRTIs药物有：齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨（DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韦等。nRTIs的结构与核苷类似，为双脱氧核苷衍生物，可与细胞内核苷竞争性地结合逆转录酶，从而终止逆转录反应。通过阻断病毒RNA基因的逆转录，即阻断病毒的双股DNA的形成，使病毒失去复制的模板。此类药物首先进入被感染的细胞，然后磷酸化形成具有活性的双脱氧核苷三磷酸化合物，竞争性抑制艾滋病病毒逆转录酶，可导致未成熟的DNA链合成终结，从而病毒复制受到抑制。早期用于治疗AIDS及其相关综合征，对治疗HIV阳性/AIDS有一定的效果，可降低死亡率及机会性感染率，但不能治愈AIDS。研究表明，核苷类逆转录酶抑制剂联用，副作用大，易出现交叉耐药。

二、HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制：

随着我国免费艾滋病抗病毒治疗的开展，HIV-1病毒耐药性的监测越来越受到重视。HIV-1病毒耐药性的产生取决于两方面：病毒复制过程中的高频突变和抗病毒药物产生的选择压力。HIV-1是RNA病毒，其基因组由单链RNA转变为RNA-DNA复合物，进而反向转录为前病毒DNA，再由前病毒转录为病毒基因组RNA，整个过程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性，对转录错误无校正功能，所以转录的忠实性差，转录中的碱基错配常导致基因突变，因此HIV-1病毒复制过程中表现出很高的突变频率，每个碱基对在每轮复制中发生突变的频率约为3.4×10^-5。另一方面，HIV-1病毒复制迅速，感染初期每天可新形成10⁹～10¹⁰病毒颗粒。HIV-1病毒的高速复制及复制过程中的高频突变，导致原发感染的几个月内就可形成非常大量的基因突变病毒。一旦突变发生在逆转录酶和蛋白酶的编码基因序列，就有可能引起逆转录酶和蛋白酶分子发生改变，导致HIV-1病毒对作用于这两种酶的抑制剂不再敏感，产生耐药性。开始抗病毒治疗后，野生型病毒被显著抑制，临床上可见到病毒载量明显下降，如果药物对病毒抑制不完全，与耐药有关的突变型仍可以持续复制。在药物产生的选择压力下，耐药突变型最终取代野生病毒株成为优势群体，临床上可表现为病毒载量的反弹。