[发明专利]一种蛋白酶K及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白酶K及其应用。

背景技术

蛋白酶K(E.C.3.4.21.64)是真菌Tritirachium album Limber合成的胞外内肽酶,它是具有典型催化三元组Asp³⁹-His⁶⁹-Ser²²⁴的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。

成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温（达65℃）和宽pH范围（pH 7.5—12.0）具有高稳定性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在要求非特异性蛋白质降解的生物技术领域中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释析。

但因为目前的Tritirachium album Limber基因的核苷酸序列不适合大规模发酵，而且难以进行基因操作，之前曾进行过在其它宿主细胞中过量表达的重组蛋白酶K的尝试，但存在着不表达、产生失活“包涵体”或者与复性有关的问题，在这些试验中没有检测到显著活性。因此，需要对其序列进行相应的改造，以满足工业生产的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白酶K及其应用，即一种具有工业应用价值的新型蛋白酶K，以弥补现有技术的不足。

本发明一个方面涉及一种蛋白酶K，包括有：

a）序列为SEQ ID NO：1的酶；

b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。

编码上述蛋白酶K的核苷酸，其优化的序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供用于表达上述蛋白酶K的重组表达质粒，是将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。

本发明还涉及携带有表达上述蛋白酶K的重组表达质粒的重组菌。

本发明筛选出的蛋白酶K能切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以用来制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶，也可以用于提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂志，比如DNA疫苗和肝素的制备等，具有工业生产应用价值。而且筛选出的蛋白酶K基因可以用来转化工程菌，从而获得具有表达蛋白酶K的重组菌。

附图说明

图1：本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的pH稳定性；

图2：本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的温度稳定性。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

1、蛋白酶K基因的合成

将Tritirachium album Limber的序列进行改造，形成新的核酸序列ProK，使ProK不被XhoⅠ和XbaⅠ两个酶切位点切断，获得的新的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。在ProK序列两端加XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，将文本序列送至生物公司（上海生工）合成，合成的ProK被连接在载体PSG-TS上, 插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。

2、蛋白酶K基因重组载体的构建

将连在PSG-TS载体上的ProK基因用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段，与同样用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37℃培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4 ml LB液体培养基中进行培养（含Amp），培养14-16小时后，提取质粒，将重组质粒pGm-ProK转入表达宿主黑曲霉G1，含有该重组质粒的重组菌株命名为G1-pGm-ProK。